Assay zur Nachahmbarkeit der Blut-Hirn-Schranke: Ein In-vitro-Assay zur Beurteilung der Durchlässigkeit von BHS-Nachahmung gegenüber Tracermolekülen

Zusammenfassung

Quelle: Le Joncour, V. et al. Vorhersage der In-vivo-Nutzlastabgabe unter Verwendung einer Blut-Hirn-Tumor-Schranke in einer Schale. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video beschreibt einen Permeabilitätsassay zur Bewertung der Permeabilität der in vitro Blut-Hirn-Schranke mit Natriumfluoresceinmolekülen.

Protokoll

1. Messung der MHK-Durchlässigkeit
   

   1. Die passive Diffusion des kleinmolekularen Fluoreszenzfarbstoffs Natriumfluorescein (Na-Fl) über die Zeit vom Blut zur Gehirnseite der Inserts ermöglicht die Berechnung der Permeabilitätswerte nach folgender Formel:
      Dabei ist dFwell der in der Vertiefung zu einem bestimmten Zeitpunkt gemessene Fluoreszenzwert abzüglich des Autofluoreszenzwerts des Zellkulturmediums, dT ist die Zeit in Sekunden, A ist die Oberfläche der Barriere in Quadratzentimetern und dFinsert ist der Fluoreszenzwert, der zum gleichen Zeitpunkt im Einsatz gemessen wird, abzüglich des Autofluoreszenzwerts des Mediums).
   2. Sammeln Sie 100 μl des Mediums sowohl aus der Blut- als auch aus der Gehirnseite des BBTB-Nachahmers und übertragen Sie jedes dieser Moleküle für nachfolgende Fluoreszenzmessungen auf eine separate schwarze 96-Well-Platte mit flachem Boden. Verwenden Sie das Normalmedium als Rohling, um die Autofluoreszenz zu korrigieren.
   3. Bereiten Sie 2,5 mL Na-Fl (50 μM) pro Vertiefung in EBM- vor. Die Na-Fl-Lösung auf 37 °C vorwärmen. Ersetzen Sie das Medium von der Blutseite der Einsätze durch das Medium, das Na-Fl enthält. Starten Sie einen Timer, sobald das Medium ausgetauscht wird.
   4. Sammeln Sie vorsichtig 100 μl Medium sowohl aus dem Blut als auch von der Gehirnseite der Einsätze nach 5, 30, 60 und 120 Minuten. Übertragen Sie jede Probe in separate Vertiefungen der schwarzen 96-Well-Platte.
   5. Tauschen Sie daher die aufgefangenen Medien aus den Einlegern aus, um das Volumengleichgewicht zwischen beiden Seiten zu erhalten. Legen Sie die Einsätze zwischen jeder Probenentnahme wieder in den Inkubator, um die Temperaturschwankungen zu minimieren.
   6. Quantifizieren Sie die Fluoreszenz aus den gesammelten Proben mit einem Platten-Reader, bei dem der Filter auf 480/560 nm eingestellt ist (Anregung bzw. Emission).
      Anmerkung: Die Fluoreszenz von der Gehirnseite ist zum Zeitpunkt von 5 Minuten nahezu nicht nachweisbar. Hohe Werte im Vergleich zum Rohling deuten auf ein Leck/eine Beschädigung der Membran des Einsatzes oder der Barriere hin; Schließen Sie diese daher von weiteren Analysen aus. Die erwarteten Na-Fl-Permeabilitätswerte für den BBTB sollten im Bereich von 10–5 bis 10–6 cm/s liegen (Tabelle 1).

Tabelle 1: Werte der Natrium-Fluorescein (Na-Fl)-Permeabilität (in Zentimetern pro Sekunde), bestimmt in vitro in den angegebenen Co-Kultursystemen und in vivo in NMRI-Nacktmäusen. Daten aus einem repräsentativen Experiment (n = 3 Mäuse).

kg kg kg kg kg Uhr kg kg kg kg kg kg kg kg kg Uhr Uhr Uhr

Murine BBTB-Nachahmung	bEND3	bEND3+HIFko As	bEND3+GB	bEND3+HIFko As+GB	im lebenden Organismus
Permeabilität (10–6 cm/s)	27,63	6,74	26,8	10,83	5,57
SD (10–6 cm/s)	3,45	3,01	7,99	2,65	2,19
Menschliche BBTB-Nachahmung	HuAR2T	HuAR2T+hIAs	HuAR2T+GB	HuAR2T+hIAs+GB
Permeabilität (10–6 cm/s)	104,92	47,4	89,08	48,24
SD (10–6 cm/s)	27,1	14.32	10.21	13.07

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Material und Reagenz
10 mL serologische Pipette	ThermoFisher Scientific	170361
ABM Basalmedium, 500 mL	Lonza	Nr. CC-3187	Für primäre menschliche Astrozyten. ABM+: enthält alle Zusatzstoffe aus der Ergänzungsmischung. ABM-: alle Zusatzstoffe außer rhEGF und FBS
Basal Medium Eagle	ThermoFisher Scientific	21010046	BME-1
Dulbecco's Modifizierter Eagle's Medium/Nährstoff F-12 Schinken	Gibco	Artikel-Nr.: 21331-020	Spezifisch für die Kultur der vom Patienten stammenden Kugeln, die in unserem Labor isoliert wurden, kann für andere Gliomzelllinien variieren
Greiner CELLSTAR 96 Well Platten S	Sigma-Aldrich	Greiner 655090	Schwarze Polystyrol-Vertiefungen mit flachem Boden (mit mikroklarem Boden)
Fluorescein-Natriumsalz	Sigma-Aldrich	Nr. F6377
FLUOstar Omega Mikroplatten-Reader	BMG Labtech
Zellen
bEND3	ATCC	CRL-2299	Kultiviert in: DMEM (1 g/l Glukose), ergänzt mit 10 % FBS, 5 ml L-Glutamin und 5 mL Penicillin/Streptomycin
HIFko immortalisierte Maus-Astrozyten	Isoliert im Labor von Dr. Gabriele Bergers	https://doi.org/10.1016/ S1535-6108(03)00194-6	Kultiviert in: BME-1, ergänzt mit 5 % FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM Natriumpyruvat, 3 g D-Glucose und 5 mL Penicillin/Streptomycin
HuAR2T	Isoliert im Labor von Dr. Dagmar Wirth	https://doi.org/10.1089/ ten.tea.2009.0184	Kultiviert in: EBM-2 mit SupplementMix
Normale primäre Astrozyten des Menschen	Lonza	Nr. CC-2565	Kultiviert in: ABM mit SingleQuots