Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für menschliches Wohlergehen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Homogenisierung
HINWEIS: Alle Schritte werden bei 4 °C ausgeführt.
- Geben Sie 1,5 ml Tricain (15 mM) in 90 mm Petrischalen mit 50 ml in 50 ml E3-Embryomedium, das mit 200 μM PTU behandelt wurde, um sie endgültig zu betäuben.
- Saugen Sie 10 betäubte Larven aus den Petrischalen mit einer 3-ml-Pasteur-Plastikpipette auf.
- Übertragen Sie anästhesierte Larven 10 x 10 in eine 55-mm-Petrischale, die mit eiskaltem E3-Embryomedium + Tricain gefüllt ist.
- Richten Sie unter einem Stereomikroskop 10 Larven in der Mitte der Petrischale aus. Dann werden die Larvenköpfe über dem Dottersack mit einer chirurgischen Mikroschere durchtrennt (Schwimmblase ausgenommen, um schwebende Köpfe zu vermeiden).
- Saugen Sie die Köpfe aus den Petrischalen mit einer 3-ml-Pasteur-Kunststoffpipette auf. Warten Sie, bis sich alle Köpfe in der Pipettenspitze versammelt haben, und geben Sie sie dann in einen Glashomogenisator mit 1 mL eiskaltem Medium A (in einem minimalen Volumen übertragen, um die Verdünnung von Medium A durch E3 + Tricain zu reduzieren). Halten Sie den Glashomogenisator auf Eis. Es wird ein Homogenisator pro Versuchsbedingung verwendet.
- Ersetzen Sie jede kleine Petrischale, die eiskaltes E3 + Tricain enthält, alle 30 Minuten durch eine neue, um sicherzustellen, dass die Durchtrennung in kaltem E3 + Tricain-Medium durchgeführt wird.
- Setzen Sie das eiskalte Medium A in den Glashomogenisator ein, wenn die Farbe zu verblassen beginnt.
HINWEIS: Medien Eine Verdünnung kann das Kopfgewebe aufgrund von Temperaturänderungen verändern.
- Sobald alle Köpfe gesammelt wurden (600 Köpfe/Zustand), entfernen Sie das maximale Volumen von Medium A aus dem Glashomogenisator und ersetzen Sie es durch 1 mL frisches, eiskaltes Medium A.
- Zerkleinern Sie das Hirngewebe mit einem dichten Glashomogenisator auf Eis. Führen Sie 40 Runden Zerkleinern und Umdrehungen für 3–5 dpf Larven und 50 für 7 und 8 dpf Larven durch.
- Geben Sie 2 ml Medium A in die Zellsuspension (1 mL Medium A/200 Köpfe), wodurch die Zellen verdünnt und ihre Agglomeration mit Myelin reduziert wird, um ihre Trennung während der Zentrifugation in Dichtegradientenmedium zu erleichtern.
- Um die Zellagglomeration zu vermeiden, lassen Sie die Zellsuspension durch ein 40-μm-Zellsieb laufen, das auf ein kaltes 50-ml-Falcon-Röhrchen gelegt wird, das auf Eis gehalten wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3 Mal.
- 1 ml Zellsuspension in kalte 1,5 ml-Röhrchen überführen und bei 300 g für 10 min bei 4 °C schleudern.
- Entfernen Sie den Überstand mit einer 10-ml-Spritze + Nadel 23G x 1''.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 1 mL eiskaltem Medium mit einem Dichtegradienten von 22 %, das sanft mit 0,5 mL eiskaltem DPBS 1x überlagert wird (nicht mischen, es wird eine Interphase zwischen beiden Lösungen zu sehen sein).
- Spin Tubes bei 950 g ohne Bremse und langsamer Beschleunigung für 30 min bei 4 °C.
HINWEIS: Dieser Schritt trennt Myelin von anderen Zellen, indem es an der Interphase von DPBS 1x und 22% Dichtegradientenmedium sequestriert wird, während die Zellen am Boden des Röhrchens pelletieren. Die Myelinentfernung ist effizienter, wenn die Zellkonzentration nicht zu hoch ist.
- Mit einer 10-ml-Spritze + Nadel 23G x 1'' verwerfen Sie das Maximum an DPBS, Dichtegradientenmedium und Myelin, die an ihrer Interphase eingeschlossen sind.
- Waschen Sie die Zellen mit 0,5 mL Medium A + 2 % normalem Ziegenserum (NGS) und schleudern Sie die Röhrchen bei 300 g für 10 min bei 4 °C.
- Das Maximum des Überstands wird verworfen und dann alle Zellpellets aus derselben Versuchsbedingung in 1 ml Medium A + 2 % NGS zusammengefasst.
- Wenn die interessierenden Zellen fluoreszierende proteinähnliche Makrophagen/Mikroglia aus mpeg1:eGFP oder Neuronen aus NBT:DsRed-transgenen Fischen exprimieren, lassen Sie die Zellsuspension durch eine 35-μm-Zellsiebkappe laufen und überführen Sie sie in ein kaltes 5-ml-FACS-Röhrchen auf Eis, geschützt vor Licht.
HINWEIS: Alternativ kann eine Immunfärbung von Mikroglia durchgeführt werden.