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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Immunfärbung von Mikroglia
HINWEIS: Alle Schritte werden bei 4 °C durchgeführt.
- Resuspendieren Sie das aus Gehirnkulturzellen gewonnene Zellpellet mit 0,3 ml Medium A + 2 % normalem Ziegenserum oder NGS. Teilen Sie sie in 3 x 1,5-ml-Röhrchen auf: eines für ungefärbte Zellen zur Messung der Autofluoreszenz von interessierenden Zellen, das zweite für den Sekundärantikörper (1/200) zur Messung der unspezifischen Bindung des Sekundärantikörpers an Mikroglia und das dritte als Test (monoklonaler 4C4-Maus-Antikörper (Mikroglia-spezifisch) (1/20) + Sekundärantikörper (1/200)).
- Geben Sie den Zellen (alle Röhrchen) ein niedriges Endotoxin, azidfrei (LEAF) in einer Menge von 1 %, um CD16/CD32-Wechselwirkungen mit der Fc-Domäne von Immunglobulinen zu blockieren. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang unter leichtem Rühren alle 5 Minuten.
- Geben Sie den 4C4-Antikörper (1/20) in die Zellen (Röhrchen 3) und inkubieren Sie 30 Minuten lang unter leichtem Rühren alle 10 Minuten.
- Schleudern Sie die Röhrchen bei 300 g für 10 min bei 4 °C und entsorgen Sie dann den Überstand.
- Einmal mit 0,5 mL Medium A + 2% NGS waschen, dann die Röhrchen bei 300 x g für 10 min bei 4 °C schleudern.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 0,5 ml Medium A + 2 % NGS und inkubieren Sie die Zellen mit LEAF bei 1 % für 10 Minuten unter sanftem Rühren alle 5 Minuten.
- Geben Sie den Sekundärantikörper (1/200) in die Zellen (Röhrchen 2 und 3). Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang unter sanftem Rühren alle 10 Minuten und Lichtschutz.
- Röhrchen mit 300 g für 10 min bei 4 °C drehen, dann Überstand entsorgen.
- Waschen Sie zweimal mit 0,5 mL Medium A + 2 % NGS und resuspendieren Sie das Zellpellet dann mit 1 mL Medium A + 2 % NGS.
- Lassen Sie die Zellsuspension durch eine 35 μm Zellsiebkappe laufen und überführen Sie sie in kalte 5 mL fluoreszenzaktivierte Zellsortier- oder FACS-Röhrchen auf Eis, geschützt vor Licht.
>2. Sortierung von Zellen (FACS)
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte bei 4 °C aus.
- Sortieren Sie Neuronen, Makrophagen/Mikroglia und Mikroglia mit einem FACS.
HINWEIS: Dieser Schritt wird in der Regel von einem Mitarbeiter der FACS-Einrichtung durchgeführt, und die Einstellungen hängen von der Art der verwendeten Ausrüstung ab.
- Geben Sie DAPI in einer Konzentration von 1 μg/ml in jedes FACS-Röhrchen, um tote Zellen zu markieren.
- Richten Sie FACS ein und sortieren Sie Neuronen, Makrophagen/Mikroglia oder Mikroglia aus allen Gehirnzellen. Trennen Sie die Zellen von den Ablagerungen in Abhängigkeit von ihrer Größe und Körnung, und trennen Sie die einzelnen Zellen durch Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung. Schließen Sie tote Zellen durch DAPI-Markierung aus lebenden Zellen aus. Identifizieren Sie Neuronen, Makrophagen/Mikroglia oder Mikroglia anhand ihrer jeweiligen positiven Färbung.
- Sammeln Sie die Zellen in 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml eiskaltem Medium A + 2 % NGS auf Eis. Verwenden Sie für jeden Zelltyp unterschiedliche Röhrchen.
- Röhrchen bei 300 x g für 10 min bei 4 °C drehen und dann den Überstand verwerfen.
- Einmal mit 0,5 ml Medium A waschen und dann den maximalen Überstand verwerfen.