Short Hairpin RNA-vermittelter Gen-Knockdown in iHSPCs in vitro: Ein Lentivirus-basiertes shRNA-Expressionssystem zur Verabreichung in iHSPCs für den Knockdown der spezifischen Genexpression

Zusammenfassung

Quelle: Hsiao, Y. L., et al. Studie der Entwicklung dendritischer Zellen durch kurzen Haarnadel-RNA-vermittelten Gen-Knockdown in einer hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzelllinie in vitro. J. Vis. Exp. (2022).

In diesem Video demonstrieren wir eine Methode zur Transduktion von lentiviralen shRNA-Vektoren, um stabile Knockdown-Zelllinien in immortalisierten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (iHSPCs) zu erhalten.

Protokoll

>1. Präparation von immortalisierten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzelllinien (iHSPCs)

1. Bewahren Sie die iHSPC-Zelllinie in einem vollständigen RPMI 1640-Medium auf, das 100 ng/ml FL und 1 μM β-Östradiol enthält.
2. Passieren Sie die Zellen im Verhältnis 1:10 alle 3 Tage.
   Anmerkung: Stellen Sie RPMI 1640 Medium vollständig her, indem Sie es mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 5 ^x10-5 M β-Mercaptoethanol und 10 μg/ml Gentamicin ergänzen. Rekombinantes murines FL ist ebenfalls kommerziell erhältlich.

>2. Lentivirale Transduktion

1. Platten iHSPCs mit einer Dichte von 1 x 10⁵ Zellen/Well in 12-Well-Platten in 1 ml vollständigem Medium, das 100 ng/mL FL, 1 μM β-Estradiol und 8 μg/mL Polybren enthält.
   Anmerkung: Die Konzentration von Polybren hängt von den Zelltypen ab und liegt in der Regel im Bereich von 4-8 μg/ml.
2. Fügen Sie shRNA-tragende Lentiviren in jede Vertiefung bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 100,
   Anmerkung: Der lentivirale Vektor ist pLKO.1-Puro mit einem Puromycin-Selektionsmarker (Abbildung 1). Die Zielsequenzen von shRNAs gegen LacZ, Tcf4 bzw. Id2 sind in der Materialtabelle aufgeführt. Der MOI wird durch die Anzahl der Virionen definiert, die während der Infektion pro Zelle hinzugefügt werden.
   
3. Die Platten bei 1.100 x g für 90 min bei 37 °C drehen.
4. Die Platte mit den infizierten Zellen wird über Nacht bei 37 °C in einem Inkubator inkubiert.
   Anmerkung: Wenn die Zellen empfindlich auf Polybren reagieren, dann frischen Sie die Zellen nach der Spin-Infektion mit dem kompletten Medium ohne Polybren auf.
5. Die Zellen werden 24 h nach der Infektion mit einem vollständigen Medium mit 100 ng/ml FL und 1 μM β-Östradiol aufgefrischt.
6. Geben Sie 6 μg/ml Puromycin in das Medium, um die infizierten Zellen nach weiteren 24 h.
   auszuwählen Anmerkung: Der transduzierte lentivirale Vektor benötigt in der Regel 48 Stunden für die Expression von Genen, einschließlich des Puromycin-resistenten Gens. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration von Puromycin für jede Zelllinie optimiert ist.
7. Aktualisieren Sie das Auswahlmedium mit 100 ng/ml FL, 1 μM β-Estradiol und 6 μg/ml Puromycin alle 3 Tage und pflegen Sie die Zellen mindestens eine Woche lang, um die stabil transduzierten iHSPC-Zellen zu erweitern.
   Anmerkung: Die Puromycin-Selektion wirkt in der Regel 48 h später, und der Zeitraum der Selektion hängt vom Zelltyp ab.

Ergebnisse

Abbildung 1: Das Konstrukt des lentiviralen Vektors pLKO.1-Puro.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Mikroröhrchen	ExtraGen	RÖHRE-170-C
12-Well-Platte, mit Gewebekulturen behandelt	Falke	353043
Fötales Rinderserum (FBS)	Corning	35-010-CV
RPMI 1640 mittel	Gibco	Artikel-Nr.: 11875-085
β-Östradiol	Sigma-Aldrich	E2758-250MG
β-Mercaptoethanol (β-ME)	Sigma-Aldrich	M6250
Flt3-Ligand (FL)	hausgemacht
Polybrene	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
Puromycin	Invivogen	ant-pr-1
shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)	Das RNAi-Konsortium (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)	Das RNAi-Konsortium (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)	Das RNAi-Konsortium (TRC)