All-in-One-CRISPR-Genom-Editing: Eine Methode für den homologiegesteuerten reparaturbasierten Gen-Knock-in in kultivierten Zellen mit dem CRISPR-Cas9-System

Zusammenfassung

Quelle: Zhang, L. et al, Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T cell lines. J. Vis. Exp. (2021).

In diesem Video demonstrieren wir die All-in-One-CRISPR-Cas9-basierte Genomeditierung in kultivierten Zellen, bei der Cas9 und sgRNA den Zellen als ein einziges Plasmidkonstrukt zur Verfügung gestellt werden. Das CRISPR-Cas9-System und das gewünschte einzubringende Gen wurden durch Elektroporationstechnik in die Zellen eingeführt, um eine erfolgreiche Geneditierung zu ermöglichen.

Protokoll

>1. Elektroporation von Makrophagen und T-Zelllinien

1. Bereiten Sie Zellkulturen für die Elektroporation vor
   1. Bereiten Sie das Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) als vollständiges Wachstumsmedium für Jurkat-T-Zellen vor. Bereiten Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % FBS für die Kultivierung von RAW264.7-Makrophagen vor. Ergänzen Sie alle vollständigen Wachstumsmedien mit 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (Pen/Streptomycin), mit Ausnahme von Medien, die für die Inkubation nach der Transfektion vor der Zellsortierung verwendet werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ampicillin, Natriumsalz	MP Biomedizin	194526
Cellometer Mini Automatisierter Zellzähler	Nexcelom Biowissenschaften
DPBS (10X), kein Kalzium, kein Magnesium	ThermoFisher Scientific	14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt	HyClone	SH30022.01
Falcon 5 ml Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden	BD Biowissenschaften	352003
Fötales Rinderserum (FBS)	ThermoFisher Scientific	10099141
Jurkat	ATCC	TIB-152	https://www.atcc.org/
Kanamycinsulfat	MP Biomedizin	194531
Mehrkanal-Pipette (30-300 μL)	Eppendorf, oder ähnlich
Neon-Transfektionssystem	ThermoFisher Scientific	MPK5000
Neon-Transfektionssystem, 10 μL Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Nunc 15 mL konische sterile Zentrifugenröhrchen	ThermoFisher Scientific	339651
Pipettenspitze 0,1-20μl	Eppendorf, oder ähnlich	Tel.: 0030 075.005
Pipettenspitze 2-200μl	Eppendorf, oder ähnlich	Tel.: 0030 075.021
Pipettenspitze 50-1000μl	Eppendorf, oder ähnlich	Artikel-Nr.: 0030 075.064
pX458-DsRed2	Addgene	112219
RAW264.7	ATCC	TIB-71	https://www.atcc.org/
RPMI 1640 Mittel	HyClone	SH30027.01
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Trypanblau-Lösung, 0,4 %	ThermoFisher Scientific	15250061
1,5 mL Mikroröhrchen, PCR-sauber	Eppendorf, oder ähnlich	Tel.: 0030 125.215
24-Well-Platten mit klarem, TC-behandeltem Multi-Well-Material	Corning	3524

kg