All-in-One-CRISPR-Genom-Editing: Eine Methode für den homologiegesteuerten reparaturbasierten Gen-Knock-in in kultivierten Zellen mit dem CRISPR-Cas9-System

Zusammenfassung

Quelle: Zhang, L. et al, Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T cell lines. J. Vis. Exp. (2021).

In diesem Video demonstrieren wir die All-in-One-CRISPR-Cas9-basierte Genomeditierung in kultivierten Zellen, bei der Cas9 und sgRNA den Zellen als ein einziges Plasmidkonstrukt zur Verfügung gestellt werden. Das CRISPR-Cas9-System und das gewünschte einzubringende Gen wurden durch Elektroporationstechnik in die Zellen eingeführt, um eine erfolgreiche Geneditierung zu ermöglichen.

Protokoll

>1. Elektroporation von Makrophagen und T-Zelllinien

1. Bereiten Sie Zellkulturen für die Elektroporation vor
   1. Bereiten Sie das Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) als vollständiges Wachstumsmedium für Jurkat-T-Zellen vor. Bereiten Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % FBS für die Kultivierung von RAW264.7-Makrophagen vor. Ergänzen Sie alle vollständigen Wachstumsmedien mit 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (Pen/Streptomycin), mit Ausnahme von Medien, die für die Inkubation nach der Transfektion vor der Zellsortierung verwendet werden.
   2. Führen Sie die Subkultivierung von RAW264.7- und Jurkat-T-Zellen gemäß den Anweisungen des Lieferanten durch (siehe Materialtabelle). Bei der Subkultivierung von RAW264.7-Zellen ist die Trypsin-EDTA-Lösung (0,25 %) zu verwenden, um die Zellen abzulösen. Verwenden Sie FBS, ergänzt mit 10 % (v/v) DMSO, als Kryokonservierungsmedium für RAW264.7- und Jurkat-Zellen.
   3. Sammeln Sie Zellen in einer Dosis von 250 × g für 5 min für RAW264.7-Makrophagen und 90 × g für 8 min für Jurkat T-Zellen. Dann mit 5-10 mL 1× DPBS (ohne Ca²⁺ oder Mg²⁺ Ionen) waschen. Entfernen Sie das DPBS.
   4. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 2 mL 1× DPBS. Verwenden Sie 10 μl Zellen und mischen Sie sie mit einem gleichen Volumen von 0,2 % Trypanblau, um die Zellzahl und die Lebensfähigkeit zu schätzen.
      Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass die Zellkultur am Tag der Transfektion eine Lebensfähigkeit von >90 % aufweist.
   5. Führen Sie für ein einzelnes Knock-in-Experiment eine Elektroporation mit 10 μl Nukleofektionsspitzen mit fünf Wiederholungen durch. Berechnen Sie das benötigte Volumen für 2,0 × 106 Zellen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Waschen Sie das Zellpellet erneut mit 1× DPBS, wie in Schritt 1.1.2.
      beschrieben Anmerkung: Bei Verwendung von 10 μl Nukleofektionsspitzen werden pro Elektroporation 4,0 × 10⁵ Zellen benötigt. Dementsprechend sind mindestens 2,0 × 10⁶ Zellen für ein Knock-in-Experiment vorzubereiten.
   6. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit 0,5 mL vollständigem Wachstumsmedium (hergestellt in Schritt 1.1.1) pro Well ohne Pen/Strep vor und erwärmen Sie sie in einem 37 °C-Inkubator.

>2. Elektroporation von CRISPR/Cas9-Komponenten und der Targeting-Vektor

1. Schalten Sie das Elektroporationssystem ein. Verwenden Sie Elektroporationsparameter, die wie folgt optimiert sind: 1.400 V/20 ms/2 Pulse für RAW264.7-Makrophagen und 1350 V/20 ms/2 Pulse für Jurkat-T-Zellen.
2. Unter Berücksichtigung des Probenverlusts durch Pipettieren ist ein 55-μl-Elektroporationsgemisch in einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen herzustellen, das 2,5 μg jedes CRISPR/Cas9-Vektors enthält (pDsR-mR26-sg1 und pDsR-mR26-sg2 für den mRosa26-Locus-Knock-in und pDsR-hR26-sg1 und pDsR-hR26-sg2 für den hROSA26-Locus), 2,4 μg des linearisierten Zielvektors (pKR26-POI-iBFP oder pKhR26-POI-iBFP für mRosa26 und hROSA26)B. Knock-in, linearisiert durch EcoRI oder BamHI) und der Resuspensionspuffer R.
   Anmerkung: Um Zeit zu sparen, kann das Elektroporationsgemisch während der Zentrifugation (Schritt 1.1.5) hergestellt werden.
3. 2.0 × 10⁶ Zellen (hergestellt in Schritt 1.1.5) in dem 55-μl-Elektroporationsgemisch aus Schritt 1.2.2 resuspendieren.
4. Das Küvetten-Elektroporations-Gemisch aus Schritt 1.2.3 wird mit einer 10-μl-Nukleofektionsspitze mit einer Pipette aspiriert.
   Anmerkung: Vermeiden Sie beim Pipettieren das Einbringen von Luftblasen, die zu einem Ausfall der Elektroporation führen können.
5. Geben Sie die Probe in ein Röhrchen, das mit 3 ml Puffer E aus dem Elektroporationskit gefüllt ist.
6. Wenden Sie die Elektroporationsparameter für die beiden Zelltypen an, wie in Schritt 1.2.1 beschrieben.
7. Übertragen Sie die Probe in eine Vertiefung der 24-Well-Platte mit vorgewärmtem Medium aus Schritt 1.1.6.
8. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.4 bis 1.2.7 für die anderen vier Wiederholungen sowie für die Steuerelemente nur für den Zielvektor und den CRISPR-Expressionsvektor.
   Anmerkung: Wechseln Sie die Nukleofektionsspitze und das Röhrchen, wenn Sie zu einem anderen Zelltyp/Plasmid-DNA wechseln.
9. Kultivieren Sie die transfizierten Zellen für 48-72 Stunden, um eine Erholung nach der Elektroporation und Expression von CRISPR/Cas9-Komponenten vor der Durchflusszytometrie-Analyse oder der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) zu ermöglichen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ampicillin, Natriumsalz	MP Biomedizin	194526
Cellometer Mini Automatisierter Zellzähler	Nexcelom Biowissenschaften
DPBS (10X), kein Kalzium, kein Magnesium	ThermoFisher Scientific	14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt	HyClone	SH30022.01
Falcon 5 ml Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden	BD Biowissenschaften	352003
Fötales Rinderserum (FBS)	ThermoFisher Scientific	10099141
Jurkat	ATCC	TIB-152	https://www.atcc.org/
Kanamycinsulfat	MP Biomedizin	194531
Mehrkanal-Pipette (30-300 μL)	Eppendorf, oder ähnlich
Neon-Transfektionssystem	ThermoFisher Scientific	MPK5000
Neon-Transfektionssystem, 10 μL Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Nunc 15 mL konische sterile Zentrifugenröhrchen	ThermoFisher Scientific	339651
Pipettenspitze 0,1-20μl	Eppendorf, oder ähnlich	Tel.: 0030 075.005
Pipettenspitze 2-200μl	Eppendorf, oder ähnlich	Tel.: 0030 075.021
Pipettenspitze 50-1000μl	Eppendorf, oder ähnlich	Artikel-Nr.: 0030 075.064
pX458-DsRed2	Addgene	112219
RAW264.7	ATCC	TIB-71	https://www.atcc.org/
RPMI 1640 Mittel	HyClone	SH30027.01
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Trypanblau-Lösung, 0,4 %	ThermoFisher Scientific	15250061
1,5 mL Mikroröhrchen, PCR-sauber	Eppendorf, oder ähnlich	Tel.: 0030 125.215
24-Well-Platten mit klarem, TC-behandeltem Multi-Well-Material	Corning	3524

kg