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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Stammzellen für die Bearbeitung vorbereiten
- Züchten und kultivieren Sie humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) auf einer 6-Well-Platte mit 2,4 × 106 Zellen/Platte von Mitomycin C-inaktivierten embryonalen Fibroblasten (MEF)-Feedern, die auf Gelatine gezüchtet wurden. Bewahren Sie hPS-Zellen in 3 ml humanen embryonalen Stammzellmedien pro Vertiefung (hES-Medien) auf und züchten Sie in einem 37 °C-Inkubator mit 3 % O2/5 % CO2,
Anmerkung: Für den Erfolg dieses Protokolls ist es nicht notwendig, hPSCs in einem sauerstoffarmen Inkubator zu halten; Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass sich hPS-Zellen in einer Umgebung mit hohemO2-Gehalt schneller vermehren, daher sollten Zeiten und Zellzahlen entsprechend angepasst werden. Es sollte auch beachtet werden, dass hPSCs, die bei niedrigem Sauerstoffgehalt gehalten werden, geringere Raten an spontaner Differenzierung aufweisen.
- Zur Herstellung von 500 ml hESC-Medien kombinieren Sie 380 ml DMEM/F12, 75 ml fötales Kälberserum (FBS) und 25 ml KnockOut Serum Replacement (KSR). Fügen Sie Glutamin (1 mM Endkonzentration), 5 ml 100x nicht-essentielle Aminosäuren, 100 Einheiten/ml Penicillin-Streptomycin (P/S), basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) (4 ng/ml Endkonzentration) und 2-Mercaptoethanol (5,5 μM Endkonzentration) hinzu.
- Wechseln Sie das Medium, indem Sie das gesamte Medienvolumen (3 ml) mit einer Glaspipette und einem Vakuum entfernen. Mit einer serologischen Pipette durch 3 ml warmes hESC-Medium ersetzen. Wiederholen Sie den Medienwechsel jeden Tag, bis die hPS-Zellen zu etwa 50 % konfluent sind (Tag-1).
- Einen Tag vor dem Targeting (Tag-1) wechseln Sie das hES-Medium, entfernen Sie das alte Medium und fügen Sie warmes hESC-Medium hinzu, das mit 10 μM Y-27632 ergänzt wird.
- Bereiten Sie ebenfalls an Tag -1 ein bis zwei 6-Well- oder 10-cm-Platten mit arzneimittelresistenten MEF-Feederzellen von DR4-Mäusen vor (2,4 × 106 Zellen/Platte).
Hinweis: Generell sind 6-Well-Platten gegenüber 10-cm-Platten vorteilhaft, da sie mehr Medien aufnehmen. 6-Well-Platten stellen außerdem sicher, dass verschiedene Klone aus verschiedenen Wells unabhängig sind. Eine 10-cm-Platte ermöglicht jedoch eine einfachere Kommissionierung, je nachdem, welches Mikroskop für diesen Prozess zur Verfügung steht.
>2. Pluripotente Stammzellen bearbeiten
- Bereiten Sie Transfektionslösungen vor, indem Sie jeweils 5 μg ZFN 1 und 2 (Abbildung 1) in ein 1,5-ml-Röhrchen pipettieren. Pipettieren Sie 30 μg des Reparaturplasmids ebenfalls in dieses Röhrchen. Zum Schluss pipettieren Sie 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in das Röhrchen, um das Volumen auf 300 μl zu bringen
Anmerkung: Bereiten Sie Plasmide als Midiprep (jedes Kit ist geeignet) mit einer Mindestkonzentration von 300 ng/μl her, um das Gesamtvolumen der Transfektionslösung unter 300 μl zu halten. Es ist nicht erforderlich, eine Phenol/Chloroform-Extraktion durchzuführen, das Plasmid zu linearisieren oder ein endotoxinfreies Plasmid-Vorbereitungskit zu verwenden.
- Entfernen Sie Medien aus hPS-Zellen mit einer Glaspipette und Vakuum. Pipettieren Sie 2 ml 1x PBS warm in jede Vertiefung, um die Zellen zu waschen.
- Entfernen Sie das PBS sofort mit einer Glaspipette und vakuumieren Sie. 0,5 ml 0,25 % ige Trypsin-EDTA-Lösung direkt auf die Zellen in jeder Vertiefung geben. In den Inkubator (37 °C/5 % CO2/3 % O2) ca. 10 Min. stellen oder bis sich die Feederschicht von der Platte zu heben beginnt.
- Geben Sie 2 ml warmes esWash-Medium (470 ml DMEM/F12, 25 ml FBS, 100 Einheiten/ml P/S) in jede Vertiefung, um die Trypsinreaktion zu stoppen.
- Stellen Sie sicher, dass die Zuführzellen als Bogen abgelöst werden. Pipettieren Sie den Inhalt jeder Vertiefung in ein einzelnes konisches 50-ml-Röhrchen, wobei Sie alle Vertiefungen kombinieren. Trituieren Sie die Zellen mit einer serologischen 10-ml-Pipette. Es ist nicht notwendig, die Feeder-Schicht aufzubrechen; hPSCs lösen sich durch sanfte Verreibung von der Feederschicht. Es sollten ca. 15 ml der Zellsuspension vorhanden sein.
- Geben Sie 25 ml esWash-Medium in das Röhrchen, um das Gesamtvolumen auf 40 ml zu erhöhen. Lassen Sie große Futterstückchen 1-2 Minuten lang am Boden des Rohrs absetzen. Entfernen Sie den Überstand (~38 ml) mit einer serologischen Pipette aus dem Röhrchen und geben Sie es in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen.
- 5 min bei 190 x g herunterschleudern. Den Überstand mit einer Glaspipette aus dem Röhrchen entfernen und abdrücken. Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl 1x PBS. Kombinieren Sie mit einer zuvor hergestellten Plasmid-Transfektionslösung. Zählen Sie die Zellen in diesem Schritt. Verwenden Sie 5-10 Millionen Zellen pro Elektroporation.
- Pipettieren Sie die gesamte 800-μl-Suspension in eine 4-mm-Elektroporationsküvette und legen Sie sie 3-5 Minuten lang auf Eis. Elektroporatzellen unter Verwendung des Exponentialprogramms auf dem Elektroporationssystem mit den folgenden Parametern: 250 V, 500 μF, ∞ Widerstand und 4 mm Küvettengröße. Nach der Elektroporation die Küvette wieder für 3 Min. auf Eis legen
Anmerkung: Beobachten Sie die Zeitkonstante der Elektroporation auf dem Elektroporationssystem. Die Zeitkonstante variiert mit der Zellzahl und der DNA-Reinheit. Erfolgreiche Transfektionen haben in der Regel eine Zeitkonstante zwischen 10-14 ms, wenn die aufgeführten Bedingungen und ein Genpulser II verwendet werden. Niedrigere Elektroporationswirkungsgrade können auftreten, wenn die Zeitkonstanten von diesen Werten abweichen.
- Resuspendieren Sie elektroporierte Zellen in 18 ml warmem hESC-Medium, ergänzt mit 10 μM Y-27632. Platte 3 ml dieser Einzelzellsuspension in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte mit DR4-Feeder-Zellen geben. Rückkehr in den Inkubator (37 °C/5 % CO2/3 % O2).
>3. Selektion positiver Kolonien
- Tag 2: Entfernen Sie alle Medien mit einer Glaspipette und vakuumieren Sie. Durch 3 ml warmes hESC-Medium ersetzen, das mit 10 μM Y-27632 ergänzt wird. Tag 3: Entfernen Sie alle Medien mit einer Glaspipette und vakuumieren Sie. Ersetzen Sie es durch 3 ml warmes hESC-Medium ohne Y-27632. Tag 4: Entfernen Sie alle Medien mit einer Glaspipette und vakuumieren Sie. Zur Auswahl durch 3 ml warmes hESC-Medium ersetzen, das mit Antibiotika ergänzt ist. Zurück zum Inkubator (37 °C/5 % CO2/3 % O2).
Anmerkung: Die Art des verwendeten Antibiotikums hängt von der Resistenzkassette ab, die in der Reparaturschablone enthalten ist. Bei der Arbeit mit WIBR#3 hPSCs (NIH-Register 0079) wurden 0,5 μg/ml Puromycin, 70 μg/ml G418 (Geneticin) und 35 μg/ml Hygromycin erfolgreich eingesetzt. Die Konzentrationen für die Selektion sollten empirisch bestimmt werden, indem die minimale Konzentration des Antibiotikums festgelegt wird, die zur Abtötung von Wildtyp-Zellen innerhalb von etwa einer Woche erforderlich ist.
- Tag 5-12, täglicher Medienwechsel, jedes Mal Ersatz der alten Medien durch warme hES-Medien, die mit Antibiotika ergänzt werden.
Anmerkung: Rechnen Sie mit einer großen Menge an Zelltod. Einzelne Völker werden sich um den 8. bis 10. Tag zeigen. Reguläre hES-Medien ohne Antibiotika können nach 12-14 Tagen kontinuierlicher Selektion verwendet werden. Wenn die Zelldichte hoch ist oder der Zelltod langsam ist, sollte eine Ansäuerung des Mediums vermieden werden, und es kann erforderlich sein, das Medienvolumen (auf bis zu 4-5 ml) in den ersten Tagen der Selektion zu erhöhen.
