TALEN-vermittelte gezielte Genintegration: Verwendung von sequenzspezifischen Nukleasen für die präzise Insertion von fluoreszierenden Proteingen in hiPSCs

Abstract

Quelle: Cerbini, T. et al. Transfektion, Selektion und Kolonie-Picking von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, die TALEN-targeted mit einem GFP-Gen in den AAVS1 Safe Harbor sind. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video beschreibt eine präzise Genom-Editing-Technik in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen oder hiPSCs, bei der TALENs verwendet werden, um doppelsträngige Brüche an einem Zielort zu erzeugen, die eine homologiegerichtete Reparatur für die Genintegration von Fluoreszenzproteinen induzieren.

Protocol

>1. Vorbereitung der Basalmembranmatrix und Beschichtung von Kunststoffen

1. Legen Sie das gefrorene Basalmembran-Matrixmaterial von -20 °C auf Eis und tauen Sie es über Nacht bei 4 °C auf.
2. Nach dem Auftauen werden 2 mg Aliquots der Basalmembranmatrix in vorgekühlte Eppendorf-Röhrchen pipettiert. Lagern Sie diese bis zur Verwendung bei -20 °C.
3. Um Basalmembran-Matrix-beschichtete Platten herzustellen, tauen Sie ein Aliquot auf Eis auf, bis das letzte Stück Eis in der Eppendorf-Röhre verschwunden ist (normalerweise innerhalb von ~2 Stunden).
4. Nach dem Auftauen Basalmembranmatrix auf 12 ml kaltes (4 °C) DMEM/F12 geben....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Basalmembran-Matrix, *LDEV-frei, 10 ml	Corning	Artikel-Nr.: 354230	Bei -20 °C lagern.
DMEM/F-12	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 11320-033	Bei 4 °C lagern.
Costar 6 Well Klare, TC-behandelte Mehrfach-Well-Platten	Corning	3506
Essential 8 Medium	Lebenstechnologien	A1517001	Basalmedium bei 4 °C lagern. Supplement bei -20 °C lagern.
Y-27632 Dihydrochlorid	Tocris	Nr. 1254	Bei Raumtemperatur lagern. Nach dem Auflösen in H2O bei -20 °C lagern.
Natriumchlorid	Sigma	Nr. S5886-500G
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 15575-020
DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium	Lebenstechnologien	Nr. 14190-250
100 mm TC-behandelte Kulturschale	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Akademisch	GlobalStem	GSC-6204G	In flüssigem Stickstoff lagern.
DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat	Lebenstechnologien	Nr. 11995-040	Bei 4 °C lagern.
Definiertes fötales Rinderserum, US-Herkunft	HyClone	SH30070.03	Bei -20 °C lagern. Über Nacht bei 4 °C auftauen und aliquotieren. Aliquote bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100X)	Lebenstechnologien	Tel.: 11140-050	Bei 4 °C lagern.
4D-Nukleofector Core Unit	Lonza	AAF-1001B	Teil des Elektroporationssystems.
4D-Nucleofector X Einheit	Lonza	AAF-1001X	Teil des Elektroporationssystems.
P3 Primärzelle 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	Bei der Ankunft die Primärzelllösung entfernen und ergänzen und bei 4 °C lagern.
StemPro Accutase Reagenz zur Zelldissoziation	Lebenstechnologien	A1110501	Bei -20 °C lagern. Über Nacht bei 4 °C auftauen und vor Gebrauch ein Aliquot in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen.
NutriStem XF/FF Nährmedium	Stemgent	01-2005	Bei -20 °C lagern. Über Nacht bei 4 °C auftauen
AAVS1-TALENs (pZT-AAVS1-L1 und pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 und 52638
AAVS1-CAG-EGFP Spender mit homologer Rekombination	Addgene	Artikel-Nr.: 22212
Puromycin-Dihydrochlorid	Lebenstechnologien	Nr. A11138-03	Bei -20 °C lagern. Arbeitsaliquoten von 1 mg/ml in ddH2°C herstellen.
Einweg-Pasteur-Pipetten aus Borosilikatglas	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (gekühlt), 120 V 60 Hz	Thermo Scientific	Tel.: 75-004-521
TX-750 4 × 750 ml Schwingrotor	Thermo Scientific	75003607
Trypanblau-Lösung, 0,4 %	Lebenstechnologien	Tel.: 15250-061