>1. Vorbereitung der Basalmembranmatrix und Beschichtung von Kunststoffen
- Legen Sie das gefrorene Basalmembran-Matrixmaterial von -20 °C auf Eis und tauen Sie es über Nacht bei 4 °C auf.
- Nach dem Auftauen werden 2 mg Aliquots der Basalmembranmatrix in vorgekühlte Eppendorf-Röhrchen pipettiert. Lagern Sie diese bis zur Verwendung bei -20 °C.
- Um Basalmembran-Matrix-beschichtete Platten herzustellen, tauen Sie ein Aliquot auf Eis auf, bis das letzte Stück Eis in der Eppendorf-Röhre verschwunden ist (normalerweise innerhalb von ~2 Stunden).
- Nach dem Auftauen Basalmembranmatrix auf 12 ml kaltes (4 °C) DMEM/F12 geben, um eine Basalmembranmatrix-Beschichtungslösung herzustellen.
- Geben Sie die Basalmembranmatrixlösung in das entsprechende Kulturgefäß. Für eine 6-Well-Platte geben Sie 1 ml pro Well ab. Schwenken Sie die Platte, um sicherzustellen, dass die Basalmembran-Matrixlösung jede Vertiefung vollständig bedeckt.
- Parafilm versiegeln Sie die mit der Basalmembranmatrix beschichtete Platte/Schale und inkubieren Sie sie vor der Verwendung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur. Alternativ können mit der Basalmembranmatrix beschichtete Platten/Schalen bei 4 °C gelagert und innerhalb von 2 Wochen nach dem Beschichten verwendet werden.
Anmerkung: Geben Sie zusätzliches DMEM/F12 in die mit der Basenmembranmatrix beschichtete Platte/Schale, um ein Austrocknen zu verhindern. Bevor Sie eine 4 °C gelagerte Basalmembran-Matrix-beschichtete Platte/Schale verwenden, stellen Sie sie in eine biologische Sicherheitswerkbank und lassen Sie sie mindestens 30 Minuten lang auf Raumtemperatur kommen.
- Die Basalmembranmatrix vor der Zugabe von Medium und Zellen vollständig aspirieren.
>2. Vorbereitung des E8-Mediums
- Bereiten Sie das E8-Nährmedium vor, indem Sie das E8-Präparat über Nacht bei 4 °C auftauen.
- 10 ml E8-Basalmedium aus dem 500-ml-Vorrat nehmen und entsorgen.
- Pipettieren Sie die gesamte 10-ml-Durchstechflasche mit E8-Präparat direkt in 490 ml E8-Basalmedium. Vollständiges E8-Medium nicht in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen, da wiederholte Temperaturschwankungen das bFGF im gesamten E8-Medium abbauen können.
- Verwenden Sie das komplette E8-Medium innerhalb von 2 Wochen nach Zugabe des Nahrungsergänzungsmittels.
>3. Auftauen von iPSCs
- Nehmen Sie ein Fläschchen mit gefrorenen iPS-Zellen aus flüssigem Stickstoff und legen Sie es auf Trockeneis.
- Tauen Sie das Fläschchen in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell auf und schwenken Sie das Fläschchen im Wasserbad, bis nur noch ein winziges Eisfragment übrig ist.
- Besprühen Sie das Fläschchen mit 70% Ethanol und stellen Sie es in eine biologische Sicherheitswerkbank.
- 1 ml E8-Medium bei Raumtemperatur tropfenweise direkt in die Durchstechflasche geben.
- Die Zellsuspension wird mit einer 2-ml-Pipette tropfenweise in 9 ml E8-Medium in einem konischen 15-ml-Röhrchen überführt. Schwenken Sie das Röhrchen häufig, um sicherzustellen, dass sich die Zellen und das Medium schnell gut vermischen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min.
- Der Überstand wird aspiriert und das Zellpellet in einem geeigneten Volumen von E8, ergänzt mit 10 μM Y-27632, resuspendiert.
- Geben Sie die Zellen in eine entsprechende Anzahl von mit Basalmembranmatrix beschichteten Vertiefungen und stellen Sie sie über Nacht in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂. Es wird empfohlen, mindestens 0,2 x 10⁶ iPSC pro Vertiefung einer 6-Well-Platte zu plättieren, um eine schnelle Erholung nach dem Auftauen zu ermöglichen.
>4. Wartung und routinemäßiges Passaging von iPSCs
- Refresh E8 medium täglich.
- Überwachen Sie die Morphologie und Konfluenz von Zellen mit einem inversen Mikroskop. iPSCs von hoher Qualität wachsen in flachen Kolonien mit unterschiedlichen Grenzen; einzelne Kolonien haben ein "kopfsteinpflasterartiges" Aussehen.
- Passieren Sie die iPS-Zellen, wenn sie eine Konfluenz von ~70% erreichen.
- Bereiten Sie eine EDTA-Passaging-Lösung vor, indem Sie 0,9 g NaCl und 500 μl 0,5 M EDTA zu 500 ml DPBS hinzufügen. Gut mischen, um NaCl aufzulösen, und zum Sterilisieren mit einem Vakuumfilter versehen. Vor der Übergabe wird ein Aliquot der Lebloslösung in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmt.
- Zum Durchgang aspirieren Sie verbrauchtes Kulturmedium und waschen die Zellen einmal mit einem gleichen Volumen warmer Passierlösung. Aspirieren und pipettieren Sie genügend EDTA-Passierlösung, um die Zellen zu beschichten (1 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte).
- Legen Sie die Zellen unter ein inverses Mikroskop und beobachten Sie die iPS-Kolonien. Das Auftreten von Löchern innerhalb von Kolonien und erhöhten Rabatten sollte innerhalb von 2 bis 5 Minuten sichtbar werden.
- Saugen Sie die EDTA-Passagelösung vorsichtig an.
Geben - Sie mit einer 10-ml-Pipette 4 ml E8-Medium (bei Verwendung einer 6-Well-Platte) unter hohem Druck direkt in jede Vertiefung ab, die durchgelassen werden soll.
- Sammeln Sie die iPSC-Klumpen und teilen Sie sie in eine entsprechende Anzahl von Vertiefungen auf, abhängig vom Teilungsverhältnis von 1:8 bis 1:12. Überpipettieren Sie nicht, da die Disaggregation von Zellklumpen zu einer schlechten Lebensfähigkeit führt.
- Stellen Sie die Platte in einen Inkubator und bewegen Sie die Platte mehrmals hin und her und von einer Seite zur anderen, um die Zellen zu verteilen.
>5. Vorbereitung von MEFs und iPSCs für die Transfektion
- 48 Stunden vor der Transfektion werden iPS-Zellen im Verhältnis ~1:6 in vier oder mehr Vertiefungen einer mit Basalmembranmatrix beschichteten 6-Well-Platte passageiert, so dass sie nach zwei Tagen zu 70 % konfluent sind.
- Am nächsten Tag tauen Sie DR4 MEFs in MEF-Medium auf, das aus DMEM (hoher Glukose) besteht, ergänzt mit 10% FBS und 1x MEM-NEAA.
- DR4 MEFs in zwei 10-cm-Schalen bei ~ 2 x 10⁴ Zellen/cm² geben und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
- Am Tag der Transfektion ist das MEF-Medium 30 Minuten vor der Transfektion an iPS-Zellen auf E8 zu ändern, das mit 10 μM Y-27632 ergänzt wurde.
- Optional: 4 Stunden vor der Transfektion, ergänzen Sie die iPSC-Kultur vor der Transfektion mit Y-27632 bei einer Endkonzentration von 10 μM.
>6. Behandlung und Transfektion von iPSCs mit sanfter Zelldissoziation unter Verwendung eines Elektroporationssystems
- Entfernen Sie die P3-Primärzelltransfektionslösung aus 4 °C und lassen Sie sie ~30 Minuten lang auf Raumtemperatur kommen. Geben Sie die gesamte Zugabe von 100 μl vor der Verwendung zur Transfektionslösung.
- Warmes Reagenz für sanftzellige Dissoziation in einem 37 °C warmen Wasserbad.
- Gewinnung von AAVS1-TALENs (pZT-AAVS1-L1 und pZT-AAVS1-R1) und AAVS1-CAG-EGFP-Spender ab -20 °C.
- Nehmen Sie iPSCs aus dem Inkubator und waschen Sie sie einmal mit DPBS.
- Geben Sie 1 ml Reagenz für die sanfte Zelldissoziation pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die iPSCs 5 Minuten lang bei 37 °C oder bis mehr als 50 % der Zellen aus dem Kulturgefäß dissoziiert sind.
- Pipettieren Sie die Zellen einige Male mit einer p1000-Pipette auf und ab, um alle verbleibenden Zellen aus dem Kulturgefäß zu dissoziieren und iPS-Klumpen aufzubrechen.
- Geben Sie 2 ml E8-Medium in jede Vertiefung und pipettieren Sie mit einer 10-ml-Pipette mehrmals auf und ab, um die Zellklumpen weiter in einzelne Zellen zu zerlegen.
Anmerkung: Die Effizienz der Transfektion nimmt deutlich ab, wenn die Zellklumpen nicht ausreichend disaggregiert werden.
- Sammeln Sie iPS-Zellen in einem konischen 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 3 Minuten lang bei 100 x g.
- Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einer minimalen Menge E8-Medium.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer nach dem Auftragen eines vitalen Farbstoffs wie 0,4 % Trypanblau. Stellen Sie sicher, dass die Zellen während der Zählung ausreichend dissoziiert sind (1-3 Zellen pro "Klumpen").
- Geben Sie je 3 x 10⁶ Zellen in zwei konische 15-ml-Röhrchen und schleudern Sie sie erneut bei 100 x g für 3 min.
Anmerkung: Die Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit reduziert die Zellspannung und ermöglicht eine einfache Resuspension von iPSCs vor der Elektroporation.
- Stellen Sie das Elektroporationssystem auf das zelltypspezifische Programm für die humane embryonale Stammzelllinie H9 (Programm CB-150) ein.
- Nach der Zentrifugation wird der Überstand aus den Zellpellets abgesaugt. Zu einem Pellet geben Sie 10 μg des HR-Donors als Kontrollprobe. Dem anderen Pellet werden 10 μg des HR-Donors zusammen mit 5 μg von jedem TALEN (pZT-AAVS1-L1 und pZT-AAVS1-R1) als Versuchsprobe zugesetzt.
- Jedes Zellpellet wird in 100 μl P3-Primärzelltransfektionslösung resuspendiert und in eine Küvette überführt.
- Die Transfektion wird durchgeführt und sofort 500 μl E8-Medium bei Raumtemperatur in jede Küvette gegeben.
- Übertragen Sie die transfizierten iPSCs tropfenweise in eine 10-cm-Schale mit DR4 MEFs, die in Schritt 5.4 hergestellt wurden.
