phiC31-Integrase-vermittelte ortsgerichtete Transgenintegration: Eine Mikroinjektionstechnik zur ortsspezifischen Transgenintegration in einen Anopheles-Vektor

>1. Vorbereitung von Plasmiden für die Mikroinjektionsmischung

HINWEIS: Das hier dargestellte Protokoll beinhaltet die Verwendung von zwei Plasmiden: ein attB (Attachment Site derived from the host bacterium)-markiertes Donorplasmid, das das Transgen von Interesse trägt, und ein Helferplasmid, das die φC31-Integrase unter der Regulation des Drosophila Hsp70-Promotors exprimiert.

1. Aufreinigung von Spender- und Helferplasmiden mit einem endotoxinfreien Plasmid-Aufreinigungskit.
   Anmerkung: Sequenzieren Sie die endgültige Plasmidvorbereitung, die für die Injektion verwendet wird, um die Integrität aller Komponenten zu überprüfen.
2. Kombinieren Sie geeignete Mengen der beiden Plasmide, um eine Mischung mit einer Endkonzentration von 350 ng/μl des Donorplasmids und 150 ng/μl des Helferplasmids zu erhalten, wenn es in einem Injektionspuffer resuspendiert wird.
   Anmerkung: Bei der Berechnung des erforderlichen Mischvolumens ist zu berücksichtigen, dass 10-15 μl für jeden Tag der geplanten Injektionen ausreichend sind und die DNA im Voraus vorbereitet und bei -20 °C gelagert werden kann. Integrase-Helferplasmidkonzentrationen von 60-500 ng/μl und Donorplasmidkonzentrationen von 85-200 ng/μl wurden ebenfalls berichtet.
3. Fältigen Sie die DNA, indem Sie 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2,5 Volumen eiskaltes 100% EtOH und Vortex hinzufügen. Ein weißer Niederschlag sollte sofort sichtbar sein. Hochkonzentrierte anfängliche Plasmidpräparate (d. h. ~1 μg/μL) verbessern die Fällungseffizienz.
   Anmerkung: Haltepunkt - Der Niederschlag kann über Nacht bei -20 °C gelagert werden.
4. Zentrifugieren Sie bei 15.000 x g für 20 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 1 mL eiskaltem 70 % EtOH.
5. Waschen Sie das Pellet mit 1 mL eiskaltem 70% EtOH und zentrifugieren Sie es bei 15.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
6. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu beschädigen, und trocknen Sie es an der Luft.
7. Resuspendieren Sie das Pellet in 1x Injektionspuffer (0,1 mM Na₃PO₄, 5 mM KCl, pH 7,2, 0,22 μm Filter sterilisiert), um eine Gesamtendkonzentration von 500 ng/μl zu erreichen< br /> Anmerkung: Gehen Sie davon aus, dass während des Ausfällungsprozesses ein Teil der DNA verloren geht; Fügen Sie daher zuerst ein kleineres Volumen Injektionspuffer hinzu, überprüfen Sie die Konzentration auf einem Spektralphotometer (z. B. Nanodrop) und fügen Sie dann ein entsprechendes Restvolumen hinzu, um 500 ng/μl zu erreichen.
8. Stellen Sie sicher, dass die DNA gründlich resuspendiert wird, bereiten Sie Aliquots von je 10-15 μl vor und lagern Sie sie bei -20 °C.
9. Am Tag der Injektion ein Aliquot auftauen und 5 Minuten lang bei 15.000 x g zentrifugieren, um alle partikulären Rückstände zu entfernen.
   HINWEIS: Eine alternative Methode zur Partikelentfernung besteht darin, die Lösung durch einen 0,22-μm-Filter zu filtrieren. Vermeiden Sie das Vorhandensein von Partikelrückständen in der Injektionsmischung, da diese während der Mikroinjektion des Embryos zu einer Verstopfung der Nadel führen.

>2. Mikroinjektion von Embryonen aus einer Anopheles-Andockleine

1. Blutfüttern Sie 4-7 Tage alte Mücken 72 Stunden vor der Mikroinjektion von der gewünschten Andocklinie (d. h. für die Injektion am Montag und Dienstag füttern Sie die Weibchen am vorherigen Freitag; für die Injektion am Donnerstag und Freitag füttern Sie die Weibchen am Montag derselben Woche).
2. Blutverfütterung von Wildtyp-Mücken (WT) (d. h. Stechmücken mit dem gleichen genomischen Hintergrund wie die Andocklinie) am selben Tag; diese werden für die Auskreuzung benötigt.
   Anmerkung: Die Größe und Qualität der Blutmahlzeit beeinflussen die Qualität der Eizellen, daher wird empfohlen, immer frisches Blut zu verwenden (d. h. Blut, das innerhalb der letzten 7 Tage entnommen wurde). Die Fütterung mit dem Arm oder die Fütterung von Mäusen kann die Qualität und Quantität der Eier erhöhen, diese Methoden werden jedoch nicht empfohlen. Für die Anwendung bei Mensch und Tier sind spezifische genehmigte Protokolle erforderlich.
3. Führen Sie Mikroinjektionen von Embryonen durch
   Führen
   1. Sie Mikroinjektionen von An. gambiae-Embryonen in 25 mM NaCl durch, indem Sie den hinteren Pol des Embryos in einem 45-Grad-Winkel anvisieren. Ein detailliertes Protokoll für die Entnahme, Ausrichtung und Mikroinjektion von Embryonen finden Sie bei Pondeville et al.und Lobo et al.
   Führen
   2. Sie Mikroinjektionen von An. stephensi-Embryonen in Halogenkohlenwasserstofföl 700:27 (2:1) durch, indem Sie den hinteren Pol des Embryos in einem 30-Grad-Winkel anvisieren. Ein detailliertes Protokoll für die Entnahme, Ausrichtung und Mikroinjektion von Embryonen finden Sie in Terenius et al.und Lobo et al.
   3. Übertragen Sie die Eier sofort nach der Injektion in eine Petrischale, die mit sterilem destilliertem Wasser (pH 7,2) gefüllt ist, und versetzen Sie sie in einen insektenartigen Zustand.
4. Nach dem Schlüpfen werden die G_0-Larven täglich in eine Schale mit gesalzenem destilliertem Wasser (0,1 % Tonic-Salz) umgefüllt und zu den Puppen aufgezogen.
5. Aufzeichnung der Schlupfrate (d. h. Anzahl der geschlüpften Larven/Anzahl der injizierten Embryonen).
   Anmerkung: Die Bewegung des Embryos unterstützt das Schlüpfen, daher ist ein sanftes Schwenken wünschenswert. Das Schlüpfen sollte ~48 h nach der Injektion beginnen. Da die Injektion zu einer leichten Entwicklungsverzögerung führen kann, ist es ratsam, die Überwachung auf spät schlüpfende Larven 3-4 Tage lang fortzusetzen.