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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Protospacer-Definition und Plasmid-Konstruktion
HINWEIS: In diesem Abschnitt wird der erste Schritt der Auswahl geeigneter Protospacer für die Konstruktion der sgRNA und die weitere Ligation in pMaOri.dCas9 beschrieben (Abbildung 1). Diese Protospacer-Sequenz besteht aus einer Sequenz von 20 Nukleotiden gegen das gewünschte Ziel.
- Besorgen Sie sich die Nukleotidsequenz des Gens, das für das Silencing von Interesse ist, bei GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Senden Sie es an den CHOPCHOP-Webserver (http://chopchop.cbu.uib.no/), wobei die Parameter für Streptococcus pyogenes Cas9 und das Protospacer-benachbarte Motiv NGG definiert sind, nachdem Sie das "Fasta-Ziel" ausgewählt haben. Definieren Sie die Parameter auf "CRISPR/Cas9" und PAM (Protospacer Adjacent Motif) NGG.
- Basierend auf den erzielten Ergebnissen wählen Sie Protospacer mit dem bestmöglichen Score (grüner Pfeil) aus, die sich so nah wie möglich am 5'-Ende der kodierenden Region befinden und vor allem im Template-Strang (Minus) enthalten sind, da die sgRNA mit dem kodierenden Strang des Gens gekoppelt werden muss, um ein vollständiges Gen-Silencing zu erzielen.
Anmerkung: Das NGG-Motiv ist nicht in der endgültigen sgRNA-Sequenz enthalten.
- Verwenden Sie den lipL32-Promotor, um die einzelne Guide-RNA zu exprimieren, die eine variable 20-Nukleotid-Sequenz am 5'-Ende und eine konservierte dCas9-Gerüstsequenz enthält. Führen Sie die 20-nt-Sequenz, die als Protospacer bezeichnet wird, mit dem lipL32-Promotor (an seinem 5'-Ende) und dem sgRNA-Gerüst (3'-Ende) zusammen (Abbildung 1B).
Anmerkung: Für einen gut definierten lipL 32-Promotor verwenden Sie die Promotorregion, die -334 zur TSS (Transcription Start Site, basierend auf Zhukova et al.) umfasst. In Tabelle 1 finden Sie die endgültige sgRNA-Kassette.
- Generieren Sie die sgRNA-Kassette durch sequentielle PCR oder lassen Sie sie von einem kommerziellen Anbieter synthetisieren.
- Nachdem Sie die Kassette erhalten haben, ligieren Sie sie in das pMaOri.dCas9-Plasmid an der XmaI-Restriktionsstelle an beiden Enden (cccggg).
- Verdauen Sie sowohl die sgRNA-Kassette als auch das pMaOri.dCas9-Plasmid mit dem XmaI-Restriktionsenzym und fahren Sie mit der Ligation fort (Abbildung 1B).
- Führen Sie die Klonierungsschritte im dT-auxotrophen E. coli-Stamm π1 aufgrund des Replikationsursprungs von pMaOri (und damit auch von pMaOri.dCas9), R6K-gamma.
HINWEIS: Ein detailliertes Protokoll für die Ligation und Klonauswahl finden Sie in früheren Veröffentlichungen von Fernandes und Nascimento. sgRNA-gesteuertes dCas9 bindet an den kodierenden Strang des ausgewählten Gens von Interesse und behindert daher die RNA-Polymerase-Elongation (Abbildung 1C), was zu einem Gen-Silencing führt.
>2. Leptospira-Transformation durch Konjugation
HINWEIS: Ein grafisches Schema dieses Schritts ist in Abbildung 2 dargestellt. Zur Herstellung von HAN-Medien und HAN-Platten siehe Hornsby et al. und Fernandes et al.
- Pathogene Leptospira-Zellen werden bei 29 oder 37 °C in HAN-Medien unter Rühren gezüchtet, indem eine gesättigte Kultur in frischem HAN bei 1:100 verdünnt wird; in der Regel dauert es 4-6 Tage, bis der Serovar Fiocruz L1-130 von L. interrogans Copenhageni die entsprechende Zelldichte erreicht.
- Stellen Sie sicher, dass die Kulturen einen Außendurchmesser von 0,2 bis 0,4 bei 420 nm (2 bis 5 x 108 Zellen/ml) erreichen, bevor sie für die Konjugation verwendet werden.
Anmerkung: Da sich das HAN-Medium mit zunehmender Zelldichte verfärbt (aufgrund des in DMEM-Medien enthaltenen Phenolrots), zentrifugieren Sie (4.000 x g, 15 min, Raumtemperatur) 1 ml des Nährmediums, um Leptospiren zu entfernen, und tragen Sie den Überstand als Blindwert zur Messung des Außendurchmessers auf.
- Transformieren Sie den konjugativen E. coli-Stamm β2163, auxotroph für Diaminopimelsäure (DAP), mit dem Plasmid pMaOri.dCas9, das die sgRNA-Kassette enthält. Verwenden Sie für die Umwandlung von E. coli entweder Hitzeschockprotokolle oder Elektroporation. Schließen Sie die Transformation mit dem Plasmid pMaOri.dCas9 ohne sgRNA-Kassette als Kontrolle ein.
- Für die Hitzeschock-Umwandlung wird die Plasmid-DNA (100 ng) mit chemisch kompetenten E. coli-Zellen gemischt und 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Es wird ein Hitzeschock bei 42 °C für 90 s durchgeführt und erneut für 5 Minuten auf Eis gelegt. Die Zellen werden durch Zugabe von 1 ml LB-Medium gewonnen, 1 h lang bei 37 °C inkubiert und mit der Beschichtung fortgefahren.
- Für die Elektroporation verwenden Sie elektrokompetente Zellen, die mit 100 ng Plasmid-DNA gemischt sind. Verwenden Sie die folgenden Parameter für den Impuls: 1,8 kV, 100 Ω und 25 μF. Stellen Sie die Zellen wie oben beschrieben wieder her.
- Die transformierten Spenderzellen von E. coli werden in LB-Agar-Medium plattiert, das mit Diaminopimelinsäure (DAP) (0,3 mM) und Spectinomycin (40 μg/ml) ergänzt wird, um sie für Plasmide auszuwählen.
- Für die Konjugation wählen Sie einen Tag vor dem Tag der Konjugation (der durch Überwachung des O.D. von Leptospirenkulturen bestimmt wird) eine Kolonie aus jeder Platte aus.
- Wählen Sie eine Kolonie von E. coli β2163 aus den leeren pMaOri.dCas9-Platten und eine aus den pMaOri.dCas9sgRNA-Platten aus. Lassen Sie sie über Nacht in 10 mL LB plus DAP und Spectinomycin bei 37 °C wachsen.
- Am nächsten Tag verdünnen Sie die gesättigten Kulturen 1:100 in 10 ml frischem LB plus DAP (schließen Sie das Antibiotikum hier nicht ein) bis zu einem OD420 nm von 0,2-0,4. Normalerweise dauert es 2-3 Stunden, bis E. coli diese Dichten erreicht hat.
- Montieren Sie in einer BSL2-Biosicherheitshaube ein Filtrationsgerät, indem Sie einen Membranfilter mit einem Durchmesser von 25 mm und einer Porengröße von 0,1 μm auf der Oberseite des Glasbodens platzieren. Setzen Sie einen 15-ml-Glastrichter auf die Oberseite und halten Sie beide Teile mit Federklemmen fest. Schließen Sie das Glas an eine Vakuumpumpe an und geben Sie die Kulturen zur Filtration in den Trichter.
- Geben Sie 5 ml Leptospira-Kultur in den Trichter. Fügen Sie ein Volumen E. coli hinzu, um das Verhältnis von 1:1 auf der Grundlage der OD420nm-Werte beider Kulturen zu erhalten. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein und konzentrieren Sie die Zellen durch Filtration. Nach der Zellkonzentration im Membranfilter wird diese vorsichtig entnommen. Stellen Sie sicher, dass das Medium durch die Membran gefiltert wird.
Anmerkung: Die Filtration dauert 5 bis 10 Minuten.
- Platzieren Sie den Filter auf einer handelsüblichen EMJH-Platte (siehe Materialtabelle), die mit DAP (0,3 mM) ergänzt wird. Stellen Sie sicher, dass die Bakterienseite nach oben zeigt. Inkubieren Sie die Platten bei 29 °C für 24 h.
Anmerkung: Wenn HAN oder ergänzte hauseigene EMJH-Platten verwendet werden, können sich E. coli vermehren und das beabsichtigte Verhältnis von 1:1 überwinden, was wiederum die Konjugationseffizienz verringern kann.
- Nach 24 Stunden werden die Filter aus den Platten entnommen und jeder einzelne Filter in ein konisches 50-ml-Röhrchen gegeben.
- Verwenden Sie 1 ml flüssiges HAN-Medium, um die Zellen durch ausgiebiges Pipettieren und Vortexen von der Filteroberfläche zu lösen.
- Visualisieren Sie die zurückgewonnenen gemischten bakteriellen Lösungen durch Dunkelfeldmikroskopie, um die Lebensfähigkeit und Beweglichkeit der Zellen sowie die Leptospira:E. coli-Anteile zu überprüfen.
Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt ist eine äquivalente Anzahl von E. coli und Leptospira zu sehen.
- 100-200 μl dieser Kultur werden auf HAN-Platten verteilt, die 0,4 % inaktiviertes Kaninchenserum und 40 μg/ml Spectinomycin enthalten. Die Platten werden bei 37 °C in einer Atmosphäre von 3 % CO2 inkubiert.
stark>HINWEIS: Normalerweise bilden L. interrogans serovar Copenhageni Stamm Fiocruz L1-130 Zellen innerhalb von 5-7 Tagen auf Kontrollplatten und in 8-10 Tagen auf Spectinomycin-Platten. In diesem Stadium wachsen E. coli nicht, da sie für DAP auxotroph sind.
- Als Kontrolle werden Kulturen mit 104 Leptospiren/ml verdünnt und 100 μl auf Platten ohne Antibiotikum gegeben, um das leptospirale Wachstum zu überwachen.