siRNA Reverse Transfection-basiertes Gen-Silencing in vitro: Ein Verfahren zur Verabreichung kleiner interferierender RNA in kultivierten Zellen zur Inaktivierung der Zielgenexpression

Zusammenfassung

Quelle: Jager, J. et al.Ein Adipozyten-Zellkulturmodell zur Untersuchung des Einflusses der Protein- und Mikro-RNA-Modulation auf die Adipozytenfunktion. J. Vis. Exp. (2021).

In diesem Video beschreiben wir ein Verfahren zur reversen Transfektion von siRNA in Adipozyten, um die Expression eines Zielproteins zu modulieren.

Protokoll

>1. Vorbereitung von vorbeschichteten Platten

1. Am Tag vor oder einige Stunden vor der Transfektion ist eine Lösung von Kollagen Typ I mit 100 μg/ml in 30 % Ethanol aus einer Stammlösung mit 1 mg/ml herzustellen. Fügen Sie 250 μl Kollagen pro Vertiefung einer 12-Well-Platte und 125 μl pro Vertiefung einer 24-Well-Platte hinzu und verteilen Sie die Lösung auf der Oberfläche der Well.
2. Lassen Sie die Platte ohne Deckel unter der Kulturhaube, bis das Kollagen getrocknet ist. Zweimal mit der phosphatgepufferten Kochsalzlösung von Dulbecco (D-PBS) waschen.
   HINWEIS: Vorbeschichtete Platten sind käuflich zu erwerben.

2. Vorbereitung der Transfektionsmischung

HINWEIS: Die Endkonzentration von siRNA liegt zwischen 1 und 100 nM (1 bis 100 pmol siRNA pro Vertiefung einer 12-Well-Platte). Die Endkonzentration der miR-Nachahmung beträgt 10 nM (10 pmol/Well). Bestimmen Sie vor Beginn des Experiments die beste Konzentration jeder siRNA, miR-Nachahmung oder eines anderen Oligonukleotids, um Off-Target-Effekte zu vermeiden. Führen Sie Transfektionsexperimente in dreifacher Ausfertigung durch, um die statistische Analyse der Ergebnisse zu erleichtern. Bereiten Sie alle überschüssigen Reagenzien vor, um den normalen Verlust beim Pipettieren auszugleichen.

1. Mischen Sie die siRNA (oder andere Oligonukleotide) durch Pipettieren (Volumen/Volumen) mit verbessertem minimal essentiellem Medium (Tabelle 1). 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
2. Geben Sie das Transfektionsreagenz und das verbesserte Minimal Essential Medium zur siRNA und pipetieren Sie es zum Mischen (Tabelle 1). 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren (während dieser Zeit mit Abschnitt 3 fortfahren). Geben Sie die Transfektionsmischung in jede Vertiefung der kollagenbeschichteten Platte.

>3. Präparation der 3T3-L1-Adipozyten

1. Waschen Sie die Zellen in der 100 mm Petrischale zweimal mit D-PBS. Geben Sie 5x Trypsin in die Zellen (1 mL pro 100 mm Schale) und achten Sie darauf, dass die gesamte Oberfläche mit dem Trypsin bedeckt ist. Warten Sie 30 s und entfernen Sie vorsichtig das Trypsin.
2. Inkubieren Sie die Petrischale für 5-10 min bei 37 °C im Inkubator. Tippen Sie auf die 100-mm-Schüssel, um die Zellen zu lösen.
3. Fügen Sie 10 ml DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 10 % FCS und 1 % Penicillin und Streptomycin hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Pipettieren Sie das Medium vorsichtig auf und ab, um die Zellen abzulösen und die Zellsuspension zu homogenisieren.
4. Zählen Sie die Zellen mit einer Malassez-Zählkammer oder einem automatisierten Zellzähler und stellen Sie die Konzentration der Zellen auf 6,25 x 10⁵ Zellen/ml Medium ein. 800 μl der Zellsuspension/Vertiefung einer 12-Well-Platte (5 x 10⁵ Zellen) oder 400 μl der Zellsuspension/Vertiefung einer 24-Well-Platte (2,5 x 10⁵ Zellen) mit der Transfektionsmischung aussäen.
   Anmerkung: Eine 100-mm-Petrischale mit Adipozyten ermöglicht die Zubereitung einer 12-Well-Platte oder einer 24-Well-Platte. Eine 100-mm-Schale enthält normalerweise 6-7 x 10⁶ Adipozyten, was 5 x 10⁵ Adipozyten pro Vertiefung einer 12-Well-Platte entspricht.
5. Inkubieren Sie die Platten in einem Zellkultur-Inkubator (7% CO2 und 37 °C) und stören Sie die Zellen 24 h lang nicht. Ersetzen Sie den Überstand am nächsten Tag vorsichtig durch frisches DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 10 % FCS und 1 % Penicillin und Streptomycin.
   HINWEIS: Es ist auch möglich, die Zellen in kollagenvorbeschichtete 48- und 96-Well-Platten zu säen, aber treffen Sie beim Austausch des Mediums mehr Vorsichtsmaßnahmen, um eine Ablösung der Adipozyten zu vermeiden.

	Pro Vertiefung (12-Well-Platte)	Pro Well (24-Well-Platte)
Oligonukleotide	20 μL	10 μL
(si-RNA, miR...)
Verbessertes Minimal Essential Medium	ca. 20 μl	10 μL
Transfektionsreagenz	5,6 μl	2,8 μl
Verbessertes Minimal Essential Medium	154,4 μl	77,2 μL
Gesamtvolumen der Transfektionsmischung	200 μL	100 μL

Tabelle 1: Erforderliche Transfektionsreagenzien für 12-Well- und 24-Well-Plattenformate.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
12-Well-Gewebekulturplatte	Dutscher	353043
2,5% Trypsin (10x)	Gibco	Artikel-Nr.: 15090-046	Verdünnt auf das 5-fache mit D-PBS
2-Propanol	Sigma	Nr. I9516
3-Isobutyl-1-methylxanthin	Sigma-Aldrich	Nr. D5879
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma	Nr. A7030
Kollagen Typ I aus Kalbsleder	Sigma-Aldrich	Nr. C8919
Dexamethason	Sigma-Aldrich	Nr. D1756
D-PBS	Gibco	14190144
Dulbecco's Modifiziertes Adler-Medium (DMEM)	Gibco	41965062	4,5 g/L D-Glukose; L-Glutamin; kein Pyruvat
Ethanol	Sigma	Artikel-Nr.: 51976
miRIDIAN micro-RNA ahmt nach	Horizont-Erkennung
FAM-markierte siRNA mit Negativkontrolle	Invitrogen	AM4620
Serum für Neugeborene	Gibco	Nr. 16010-159
Fötales Rinderserum	Gibco	Nr. 10270-106
Penicillin und Streptomycin	Gibco	Nr. 15140-122
FAM-markierte siRNA mit Negativkontrolle	Invitrogen	AM4620
ON-TARGETplus Maus Plin1 siRNA SMARTpool	Horizont-Erkennung	Nr. L-056623-01-0005
Freies Glycerin-Reagenz	Sigma-Aldrich	Nr. F6428
Petrischale 100 mm x 20 mm	Dutscher	353003
Transfektionsreagenz (INTERFERin)	Polyplus	Nr. 409-10
Verbessertes Minimal Essential Medium (Opti-MEM)	Gibco	Artikel-Nr.: 31985-047
Insulin, humane rekombinante	Gibco	Artikel-Nr.: 12585-014