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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Transfektion des Antwortplasmids, das das interessierende Gen (GOI) exprimiert, in primäre Alveolarepithelzellen
- Isolierung von Alveolarepithelzellen vom Typ II aus der Lunge von Ratten.
- Die Zellen werden mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen/cm,2 in 100 mm Petrischalen mit einem vollständigen Minimum an essentiellem Medium (vollständiges MEM) ausgesät. Vollständiges MEM ist MEM, das mit 10 % FBS, 0,08 mg/l Tobramycin, Septra (3 μg/ml Trimethoprim und 17 μg/ml Sulfamethoxazol), 0,2 % NaHCO3, 0,01 M HEPES (pH = 7,3) und 2 mM L-Glutamin ergänzt wird. Die Zellen werden 24 h lang bei 37 °C in 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator kultiviert.
- Am nächsten Tag 500 μl komplettes MEM ohne Antibiotikum in jede Vertiefung einer neuen 12-Well-Platte geben und die Platte 30 min lang bei 37 °C vorwärmen. Während dieses Schritts ist es wichtig, fötales Rinderserum zu verwenden, das frei von kontaminierenden Tetracyclinen ist oder einen zu niedrigen Gehalt aufweist, um die Induzierbarkeit zu beeinträchtigen.
- Bereiten Sie 1,5-ml-Röhrchen vor, die das Plasmid mit der induzierbaren GOI (GOI-Plasmid) und dem regulatorischen Vektor (z. B. pTet-Off) enthalten, indem Sie 1 μg GOI-Plasmid und 1 μg regulatorischen Vektor pro Vertiefung bei RT hinzufügen. Für Koexpressionsexperimente mit RNA-bindenden Proteinen (RBP) wird 1 μg eines konstitutiven Vektors (z. B. pcDNA3), der das interessierende RPB exprimiert, zum DNA-Mix hinzugefügt (Abbildung 4).
- Saugen Sie das Medium an und spülen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS (ohne Calcium und Magnesium), das auf 37 °C vorgewärmt wird.
- Fügen Sie 5 ml 0,05% Trypsin hinzu, das bei 37 °C vorgewärmt wurde, und inkubieren Sie die Zellen, bis sich die Zellen gelöst haben (2-4 Minuten). Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie 10 ml vollständiges MEM ohne Antibiotikum hinzufügen.
- Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50-ml-Röhrchen, waschen Sie die Petrischale mit 4 mL Medium, um so viele verbleibende Zellen wie möglich zu sammeln, und zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension bei 300 x g für 5 Minuten.
- Den Überstand vorsichtig aspirieren und verwerfen und das Pellet in 1 ml PBS resuspendieren. Zählen und berechnen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.
- Die Zellen werden 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig abgesaugt und das Pellet in einem Resuspensionspuffer in einer Konzentration von 4 x 107 Zellen/ml resuspendiert. Geben Sie die Zellen aus dem in Schritt 2.4 vorbereiteten 1,5-ml-Röhrchen in einer Konzentration von 400.000 Zellen pro Vertiefung hinzu und mischen Sie sie vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren.
- Legen Sie das Röhrchen in das Elektroporationsgerät und füllen Sie es mit 3,5 mL elektrolytischem Puffer.
- Führen Sie eine vergoldete Elektrodenspitze in eine Pipette ein, indem Sie den Kolben vollständig drücken. Mischen Sie den Inhalt des 1,5-ml-Röhrchens vorsichtig und aspirieren Sie die Zellen vorsichtig mit der Pipette. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in die Spitze gelangen, da dies während der Elektroporation zu Lichtbögen und zu einer verminderten Transfektionseffizienz führt.
- Führen Sie die Pipette in die Elektroporationsstation ein, bis ein Klickgeräusch zu hören ist.
- Wählen Sie das geeignete Elektroporationsprotokoll für Alveolarepithelzellen aus, das einer Pulsspannung von 1.450 V und 2 Pulsen mit einer Breite von 20 ms entspricht, und drücken Sie auf dem Touchscreen auf Start.
- Entfernen Sie unmittelbar nach der Transfektion die Pipette und überführen Sie die Zellen in eine zuvor mit vollständigem MEM ohne Antibiotikum gefüllte Vertiefung, die auf 37 °C vorgewärmt wurde.
- Die Schritte 1.11 bis 1.14 für die restlichen Proben wiederholen.
- Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig auf der Well-Oberfläche zu verteilen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator. Ersetzen Sie nach 2 Tagen das Medium durch vollständiges MEM mit Antibiotika.
- Bestätigen Sie den Erfolg der Transfektion, indem Sie die Expression von eGFP unter einem Fluoreszenzmikroskop oder durch Durchflusszytometrie mit einem Kontrollvektor beobachten (Abbildung 1).
Anmerkung: Dieser Schritt ist optional und erfordert einen zusätzlichen Transfektionsschritt unter Verwendung eines anderen Plasmids, das eGFP exprimiert, wie z. B. pcDNA3-EGFP.
>2. Induktion der Transkriptionshemmung der GOI
HINWEIS: Die Zellen können vor der Doxycyclin-Induktion mit den gewünschten Behandlungen vorbehandelt werden, um ihren Einfluss auf die mRNA-Stabilität zu beurteilen (Abbildung 3).
- Bereiten Sie eine Doxycyclin-Stammlösung von 1 mg/ml in entionisiertem Wasser vor. Lagern Sie die Stammlösung bei -20 °C lichtgeschützt. Doxycyclin, ein Tetracyclin-Derivat, wird anstelle von Tetracyclin verwendet, da es eine längere Halbwertszeit (2x) als Tetracyclin hat. Darüber hinaus ist eine niedrigere Konzentration von Doxycyclin für die vollständige Inaktivierung des Tet-Operons erforderlich.
Anmerkung: Doxycyclin könnte die mRNA-Expression der endogenen GOI beeinflussen. Um dies zu überprüfen, sollte die Wirkung einer 24-stündigen Behandlung mit Doxycyclin auf Alveolarzellen getestet werden, um zu bestätigen, dass keine Veränderungen der GOI-Expression vorliegen (Abbildung 2).
- Bereiten Sie eine frische 1 μg/ml-Doxycyclin-Lösung in vollständiger MEM 72 h nach der Transfektion vor und erwärmen Sie sie auf 37 °C.
- Das Medium wird durch 1 ml vollständiges MEM mit 1 μg/ml Doxycyclin pro Vertiefung ersetzt, um die Transkription der GOI zu hemmen.
- Mehrere Vertiefungen werden bei 37 °C in 5 % CO2 für unterschiedliche Zeiträume von 15 min bis 6 h inkubiert, um die mRNA-Halbwertszeit der GOI zu bestimmen.
- Waschen Sie die Zellen am Ende der Behandlung mit eiskaltem PBS und lysieren Sie sie mit einem handelsüblichen Phenol-Chloroform-RNA-Extraktionskit, indem Sie 500 μl Puffer pro Vertiefung hinzufügen und die Platte schütteln, um die Zellen zu homogenisieren.
- Isolieren Sie die RNA gemäß dem Protokoll des Herstellers. Bestimmen Sie die RNA-Ausbeute und -Reinheit durch Spektrophotometrie bei 230, 260 und 280 nm. RNA-Proben mit einem Verhältnis von 260:230 und 260:280 von 1,8 bzw. 2,0 gelten als rein.
Anmerkung: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
