Binäre bakterielle künstliche Chromosomenvektor-basierte Gentransformation in Arabidopsis-Pflanzen: Eine Technik zur Erzeugung transgener Pflanzen mit Single-Copy-Insertion

1. Arabidopsis Transformation

1. Bereiten Sie die Arabidopsis-Pflanzen für die Umwandlung vor.
   1. Ziehen Sie Arabidopsis-Pflanzen in einem Gewächshaus oder einer klimatisierten Wachstumskammer an, bis sie blühen (12 Töpfe mit je 9 Pflanzen pro Dip).
   2. Schneiden Sie die ersten Schrauben ab, damit weitere Sekundärschrauben hervortreten können. Die Pflanzen sind 4–6 Tage nach dem Schnitt bereit zum Tauchen, wenn die Pflanzen viele unreife Blütenköpfe und nicht viele befruchtete Siliques haben.
2. Florales Tauchen
   1. Tauchen Sie die Blütenstände für 5–10 Sekunden in eine Agrobacterium-Suspension mit T-DNA, die mit binärem bakteriellem künstlichem Chromosom oder BIBAC kloniert wurde. Sanftes Rühren verwenden.
   2. Wickeln Sie die oberirdischen Teile der Pflanzen in Frischhaltefolie ein, um die Luftfeuchtigkeit hoch zu halten, und decken Sie die Pflanztöpfe mit einer Schachtel ab, um die Pflanzen im Dunkeln zu halten. Inkubieren Sie die Pflanzen 2 Tage lang in einem Gewächshaus/einer Wachstumskammer.
   3. Entfernen Sie die Schachtel und die Frischhaltefolie und lassen Sie die Pflanzen in einem Gewächshaus/einer Wachstumskammer zur Reife heranwachsen.
      Anmerkung: Um die Effizienz der Umwandlung zu erhöhen, können dieselben Pflanzen 7 Tage nach dem ersten Eintauchen erneut getaucht werden.
   4. Ernte die Samen. Bündeln und analysieren Sie die Samen (T1) von Pflanzen, die mit demselben Konstrukt transformiert wurden, als ein einziges Set.
3. Screening auf transgene Pflanzen.
   1. Um nach transgenen Pflanzen zu suchen, die mit einem pBIBAC-RFP-GW-Derivat transformiert wurden, analysieren Sie die Samen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie. Um die DsRed-Expression in Samenschalen nachzuweisen, bilden Sie die Samen bei einer Anregung von 560 nm und einer Emission von 600–650 nm ab. Trennen Sie die fluoreszierenden Seeds mit einer Pinzette von den nicht fluoreszierenden Gegenstücken.
   2. Um nach transgenen Pflanzen zu suchen, die mit einem pBIBAC-BAR-GW-Derivat transformiert wurden, säen Sie die Samen in mit Erde gefüllte Schalen (~2.500 Samen/0,1 m²). Um eine gleichmäßige Verteilung der Samen auf den Schalen zu gewährleisten, suspendieren Sie die Samen in 0,1 % Agar in 0,5x Murashige Skoog Medium (MS) und verteilen Sie die Samen mit einer 1-ml-Pipette.
      Anmerkung: Um die Samen zur synchronen Keimung anzuregen, inkubieren Sie die Samen mindestens 2 Tage lang bei 4 °C. Dies kann vor oder nach der Aussaat der Samen erfolgen.
      1. Besprühen Sie die Sämlinge 2 Wochen und 3 Wochen nach der Aussaat in Schalen mit 0,5%iger Glufosinat-Ammonium-Lösung. Verwenden Sie 500 ml Glufosinat-Ammonium-Lösung pro 1 m².
      2. Setzen Sie die überlebenden Sämlinge in einzelne Töpfe um. Ein typisches Bild einer Schale mit Sämlingen vor und nach der (zweiten) Glufosinat-Ammonium-Behandlung ist in Abbildung 1 dargestellt.
      3. Analysieren Sie die Glufosinat-Ammonium-resistenten Pflanzen mittels PCR auf das Vorhandensein des interessierenden Konstrukts.
         1. Isolieren Sie die genomische Pflanzen-DNA für die PCR.

Abbildung 1: Mit Arabidopsis-Sämlingen gefülltes Tablett vor und nach der Glufosinat-Ammonium-Behandlung. Sämlinge, die das in der pBIBAC-BAR-GW T-DNA vorhandene Bar-Gen nicht exprimieren, sterben nach dem Besprühen mit Glufosinat-Ammonium-Lösung. Die Fotos zeigen dieselbe Schale mit Sämlingen (A) vor dem Besprühen mit Glufosinat-Ammonium, 14 Tage nach der Aussaat, und (B) 10 Tage später, nachdem sie zweimal besprüht wurden.