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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Morpholino-Oligo-Design
HINWEIS: Sequenzen für A. mexicanus sind über das National Center of Biotechnology Information (NCBI) Gene und NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) sowie über den Ensembl Genombrowser (https://www.ensembl.org) verfügbar. Bei der Entwicklung eines Morpholinos für den Einsatz sowohl in Oberflächen- als auch in höhlenbewohnenden Formen ist es entscheidend, in diesem Stadium jegliche genetische Variation zwischen den Morphen zu identifizieren, damit diese genetischen Regionen als Ziele für Morpholinos vermieden werden können. Jede polymorphe Variation innerhalb einer Morpholino-Zielstelle kann zu einer ineffektiven Bindung führen. Das Design ähnelt anderen Fischsystemen, wie z. B. dem Zebrafisch, und hat sich bereits bei A. mexicanus als effektiv erwiesen.
- Design von translationsblockierenden Morpholinos
Anmerkung: Translationsblockierende Morpholinos blockieren die Translation, indem sie an die endogene Startstelle binden und hindern die Translationsmaschinerie daran, die mRNA-Sequenz durch sterische Behinderung zu binden.
1. Identifizieren Sie die kodierende Region des Zielgens, beginnend mit der ATG-Startstelle.
2. Notieren Sie die ersten 25 Basenpaare der Zielsequenz, indem Sie die Sequenz kopieren und in einen Texteditor oder ein Labornotizbuch einfügen.
3. Generieren Sie entweder mit Online-Software (z. B. http://reverse-complement.com) oder manueller Übersetzung das umgekehrte Komplement der Zielsequenz. Speichern Sie das resultierende umgekehrte Komplement in einem Texteditor oder Labornotizbuch.
4. Bestellen Sie ein Morpholino mit der umgekehrten Komplementsequenz von einem Unternehmen, das Morpholino-Oligonukleotide herstellt. Siehe Materialtabelle für Unternehmen.
>2. Mikroinjektionen
- Vorbereitung von allgemeinen Werkzeugen für Injektionen
Anmerkung: Die Vorgehensweisen in diesem Abschnitt wurden an anderer Stelle ausführlich beschrieben, und eine Übersicht mit geringfügigen Änderungen finden Sie hier.
- Erzeugen Sie Injektionsplatten, indem Sie warme 3 % Agarose, gelöst im Wasser des Fischsystems, in eine 100-ml-Petrischale gießen. Legen Sie vorsichtig eine Eispritzgussform in die frisch gegossene Agarose, um Vertiefungen für die Fischeier zu machen. Legen Sie die Seite der Form in einem Winkel von 45° in den Agar und senken Sie sie dann langsam in die Agarose ab; Durch das langsame Absenken der Form in einem Winkel wird vermieden, dass Luft unter der Form eingeschlossen wird. Entferne den Schimmel vorsichtig, sobald die Agarose fest geworden ist. Die Platten können verschlossen bei 4 °C bis zu 1 Woche gelagert werden.
- Entnahme von Eizellen im Einzelzellstadium
- In der Nacht, in der die Brut erwartet wird, untersuchen Sie die Tanks alle 15-30 Minuten und überwachen Sie sie auf Eier am Boden des Tanks. Die Eier erscheinen durchscheinend und haben einen Durchmesser von etwa 1 mm.
- Verwende ein feinmaschiges Fischnetz, um die Eier zu sammeln und sie in eine Glasschüssel zu geben, die mit frischem Wasser aus dem Fischsystem gefüllt ist. Untersuchen Sie die Eizellen unter einem Mikroskop, um zu bestätigen, dass sich die Eizellen im Einzelzellstadium befinden.
- Mit Glaspipetten einzellige Eier auf die Injektionsplatten übertragen. Zu diesem Zeitpunkt sind Glaspipetten erforderlich, da die Eier an Plastik kleben.
- Die Eier werden mit einer Pipette vorsichtig in die Vertiefungen der Agarose-Injektionsplatte aus Abschnitt 2.1 gegeben. Füllen Sie die Reihen der vorgewärmten (bei Raumtemperatur) Injektionsplatte mit der maximalen Anzahl an Eiern (30–40 pro Reihe und bis zu fünf Reihen). Volle Reihen verhindern, dass sich die Eier während der Injektion bewegen. Halten Sie die Eier mit etwas Wasser aus dem Fischsystem auf der Injektionsplatte hydratisiert, bis die Injektionen durchgeführt werden.
- Aufbau der Pico-Injektion und allgemeine Richtlinien zur Optimierung der Injektion
- Füllen Sie die Injektionsnadeln entweder mit Gellader-Pipettenspitzen auf, die in die Kapillare passen, oder mit Standard-Mikropipettenspitzen und fügen Sie am Ende einen Bolus von 2–4 μl hinzu. Sobald die Nadel gefüllt ist, verwenden Sie eine Pinzette, um die überschüssige Länge von der Injektionsnadel abzuschneiden.
- Führen Sie Mikroinjektionen mit einer Nadel durch, die in einem Mikromanipulator montiert ist, der mit einem Pikoliter-Mikroinjektor verbunden ist.
- Stellen Sie die Einspritzzeit auf 0,03 s und den Druck auf ~0,0 psi ein. Der Injektionsdruck variiert entsprechend mit geringfügigen Unterschieden zwischen den Nadeln, also optimieren Sie, um einen Injektionsbolus von ~1,0 nL zu erreichen.
Anmerkung: Der Einspritzdruck liegt oft im Bereich von ~10–30 psi.
- Standardisieren Sie den Injektionsbolus, indem Sie in Mineralöl injizieren und die Bolusgröße mit einem Objektträgermikrometer messen, um ein Injektionsvolumen von ~1–1,5 nL zu erreichen. Passen Sie den Injektionsdruck (psi) an, um das Bolusvolumen zu erhöhen oder zu verringern.
- Ziehen Sie mit einem Labortuch Wasser von der Oberseite der Eier ab.
Anmerkung: Das Astyanax-Ei-Chorion ist etwas schwieriger zu durchdringen als Zebrafisch-Eier. Wir stellen fest, dass das Ziehen des Wassers von der Oberseite der Eier das Eindringen der Nadel in das Ei erleichtert. Die Plattenoptimierung kann ~200 Eier auf einem einzigen Teller ermöglichen.
- Mit dem Mikromanipulator dringen Sie mit der Nadel in jedes Ei ein und injizieren Sie es direkt in das Eigelb. Sobald es im Eigelb positioniert ist, injizieren Sie das Ei, indem Sie die Einspritztaste oder das Injektionsfußpedal drücken.
Anmerkung: Eine volle Platte kann innerhalb von ~15 min injiziert werden. Die Einzelzellphase dauert ~40 min.
- Injektion von morpholinos
Anmerkung: Die Menge an Morpholino, die für einen Knockdown erforderlich ist, ohne Toxizität zu verursachen, muss pro Genziel optimiert werden. Eine Konzentration von 400 pg ist jedoch ein guter Anfang.
- Bereiten Sie Morpholino so vor, dass 400 pg Morpholino pro Ei injiziert werden. Tauen Sie Morpholino auf Eis auf. Die Injektionslösung besteht aus Morpholino (in der gewünschten Konzentration), RNase-freiem H2O oder Danieau-Lösung und Phenolrot (10 % des Endvolumens). Ein Beispiel finden Sie in Tabelle 1.
- Injizieren Sie 1 nL pro Embryo.