Tol2-Transposon-vermittelte Zebrafisch-Transgenese: Ein Verfahren zur Erzeugung transgener Zebrafische nach Co-Injektion des Tol2-Systems in befruchtete Zebrafischembryonen

Zusammenfassung

Quelle: Silic, M. R., et al. Visualisierung der zellulären elektrischen Aktivität in frühen Zebrafischembryonen und Tumoren. J. Vis. Exp. (2018)

In diesem Video demonstrieren wir ein Verfahren zur Erzeugung einer stabilen transgenen Zebrafischlinie, die konstitutiv ein Fluoreszenzspannungsindikatorprotein exprimiert, nach der Co-Injektion des Tol2-Transposon-Systems, bestehend aus der Transposase-mRNA und dem Tol2-Transposon-Konstrukt, das den Fluoreszenzspannungsindikator kodiert.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Mikroinjektion

1. Richten Sie am Nachmittag vor der Injektion 4-6 Aufzuchtbecken mit mindestens 2 Rüden und 2 Hündinnen ein. Diese Fische dürfen am Nachmittag nicht gefüttert werden. Dieser Schritt reduziert die Menge an Fischabfällen und spart Zeit, um sie am nächsten Morgen zu reinigen, und hilft gleichzeitig, eine Brutreaktion auszulösen.
2. Am nächsten Morgen wird die vorbereitete Injektionslösung, bestehend aus: i) einem Tol2-Transposon-Konstrukt, das einen Zebrafisch-Ubiquitin-Promotor und das Fluoreszenzspannungsindikatorgen Accelerated Sensor of Action Potentials 1 (ASAP1) enthält, und ii) Tol2-mRNA aus dem -80 °C-Gefrierschrank entnommen und auf Eis gelegt.
3. Ziehen Sie die Trennwände in den Zuchtbecken und lassen Sie die Fische sich paaren. In der Regel legen Fische innerhalb von 20-30 Minuten nach dem Herausziehen der Trennwand Eier. Wenn nicht, warten Sie 1-2 Stunden länger. Einige Fische legen möglicherweise überhaupt keine Eier. Wiederholen Sie in diesem Fall dieses Experiment für die Entnahme von Fischembryonen.
4. Stellen Sie während des Wartens sicher, dass Nadeln vorbereitet sind, deren Spitze in einem Winkel abgebrochen wird, um eine abgeschrägte Kante mit einer Pinzette zu erzeugen, oder indem Sie mit einem empfindlichen Arbeitswischer brechen.
   1. Ziehen Sie die Nadeln aus dem Kapillarglas auf einem Mikropipettenabzieher mit den folgenden Parametern: Hitze 545; Zug 60; Geschwindigkeit 80; Zeit 250; Druck 500. Brechen Sie die Nadel mit einer Pinzette unter einem Präparierfernrohr (mit Okularlineal zur Durchmesserschätzung), indem Sie die Pinzette in einem Winkel von ca. 45° halten. Die gewünschten Nadeldurchmesser können je nach den Einstellungen des Mikroinjektors variabel sein, aber ein kleinerer Durchmesser wird bevorzugt, um die Embryonensterblichkeit zu verringern.
5. Sobald die Fische Eier gelegt haben, sammeln Sie sie in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm und bringen Sie sie zum Sezierzielfernrohr. Entfernen Sie alle abnormalen Embryonen und Fischabfälle.
6. Pipettieren Sie die befruchteten Embryonen in die vorbereitete 3%ige Agarose-Spritzform. Entferne überschüssiges Wasser, um die Embryonen an Ort und Stelle zu halten.
7. Sobald alle Reihen mit lebensfähigen Embryonen gefüllt sind, ordnen Sie sie so an, dass die einzelnen Zellen alle in die gleiche Richtung zur Nadel zeigen, was horizontal einem Winkel von etwa 45° entspricht. Dies erleichtert die spätere Injektion erheblich.
8. Verwenden Sie mit Handschuhen eine 20-μl-Ladepipettodspitze und entnehmen Sie 5 μl des vorbereiteten Konstrukts aus dem Röhrchen auf Eis.
9. Führen Sie die Spitze vorsichtig in das hintere Ende des gebrochenen Kapillarrohrs bis zu der Stelle ein, an der es zu klopfen beginnt, um das Reagenz so nah wie möglich an die Spitze zu bringen. Wenn noch Luftblasen vorhanden sind, schütteln Sie die Nadel und achten Sie darauf, dass die Spitze nicht bricht.
10. Führen Sie die Nadel gerade in den Mikroinjektionsnadelhalter ein und ziehen Sie sie vorsichtig fest, bis die Nadel an Ort und Stelle bleibt. Stellen Sie den Winkel auf ca. 45° ein.
11. Sobald die Nadel vorbereitet und angebracht ist, schalten Sie das Mikroskop und den Gasdruckbehälter ein. Kommerzielle CO₂ -Tanks eignen sich in der Regel gut für diesen Zweck. Das Einspritzvolumen wird durch den Halte- und Ausstoßdruck eingestellt: ca. 0,5 psi für den Haltedruck und 30 psi für den Auswurf. Vergewissern Sie sich, dass die Lösung beim Drücken des Pedals herauskommt.
12. Stellen Sie mit einem Tischmikrometer mit einem Tropfen Mineralöl das Volumen und den Durchfluss der Lösung auf einen Durchmesser von ~150 μm (ca. 2 nL) ein. Achte darauf, dass durch den Gegendruck eine kleine Menge aus der Nadel tropft. Wenn nicht genügend Gegendruck vorhanden ist, führt die Kapillarwirkung dazu, dass Flüssigkeit in die Nadel eindringt und die mRNA zerstört
.
13. Sobald die Nadel kalibriert ist, beginnen Sie, das Konstrukt in die einzelne Zelle der befruchteten Embryonen zu injizieren.
    Anmerkung: Dies erfordert viel Übung, Geduld und Fingerspitzengefühl, da die Zellmembran schwer zu durchdringen ist. Für die Erzeugung von transgenen Zebrafischen ist es wichtig, die Lösung und nicht das Eigelb in die Zelle zu injizieren. Dies unterscheidet sich von der Morpholino-Injektion. Es spielt keine Rolle, auf welcher Seite die Nadel in die Zelle eintritt, solange das Konstrukt in die Zelle eindringt. Die Erfolgsrate der Transgenese ist sehr gering, wenn sie in das Eigelb statt in die Zelle injiziert wird. Eine Injektion im Einzelzellstadium ist ebenfalls wichtig, da sonst somatische Chimärenfische entstehen. Dadurch wird die Wahrscheinlichkeit verringert, dass das Transgen in die Keimzellen gelangt.
14. Verwenden Sie den Rand der Gelkerbe, um eine Unterlage zu schaffen, die den Embryo an Ort und Stelle hält und es der Nadel ermöglicht, Druck auszuüben, ohne den Embryo zu bewegen. Sobald sich die Spitze der Nadel in der Einzelzelle befindet, drücken Sie das Pedal, um die gewünschte Menge der Lösung freizusetzen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Embryonen.
15. Wenn Sie fertig sind, übertragen Sie die injizierten Embryonen in eine beschriftete Schale, indem Sie sie mit Wasser aus dem Fischsystem und einer Einweg-Transferpipette von 3,4 ml aus der Agarosekerbe spülen. Lagern Sie die Embryonen in einem 28,5 °C heißen Inkubator, damit sie sich entwickeln können.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agarose RA	Amresco	N605-500G	Zur Herstellung der Injektionsgele
Umfang der Hellfeld-Dissektion	Nikon	SMZ 745	Dechorionierung, Mikroinjektion, Montage
Einweg-Transferpipette 3,4 ml	Thermo Scientific	13-711-9 Uhr	Fischembryonen und Wassertransfer
Pinzette #5	WPI	500342	Dechorionierung und Nadelbruch
Tipp zum Laden	Eppendorf	930001007	Zum Laden der Injektionslösung in die Kapilärnadeln
Mikrospritzguss-Form	Adaptive wissenschaftliche Werkzeuge	TU-1	Zur Vorbereitung der Agaorse-Formschale zum Halten von Fischembryonen während der Injektion
Mikroinjektor	WPI	Pneumatische Picopump PV820	Mikroinjektions-Injektor
Mikro-Manipulator	WPI	Mikroinjektor MM3301R	Mikroinjektionsvorgang
Abzieher für Mikropipetten	Sutter-Instrument	P-1000	Zur Vorbereitung der Kapillarnadel
Mineralöl	Amresco	J217-500ml	Zur Kalibrierung des Injektionsvolumens
Petrischalen aus Kunststoff	VWR	Artikel-Nr.: 25384-088	Zum Halten von Fischen oder Fischembryonen während des Bildgebungsprozesses
Tisch-Mikrometer	Am Geltungsbereich	MR100	Kalibrierung des Mikroinjektionsvolumens
Dünnwandige Glaskapillaren	WPI	TW100F-4	Rohglas zur Herstellung von Kappilarnadeln