PiggyBac Transposon-vermittelte Geneditierung in humanen iPSCs: Ein Verfahren zur Integration von Genen von Interesse in humanen iPSCs mit dem PiggyBac Transposon-System

Zusammenfassung

Quelle: Garone, M. G. et al. Umwandlung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) in funktionelle spinale und kraniale Motoneuronen unter Verwendung von PiggyBac-Vektoren. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Erzeugung von Motoneuronen durch Transfektion menschlicher iPSCs mit dem PiggyBac-Transposon-System durch die ektopische Expression von linienspezifischen Transkriptionsfaktoren.

Protokoll

>1. Erzeugung von NIL- und NIP-induzierbaren iPSC-Leitungen

1. Zelltransfektion
   1. Spülen Sie die Zellen mit PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ frei).
   2. Geben Sie das Zelldissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle) hinzu (0,35 mL für eine 35-mm-Schale) und inkubieren Sie bei 37 °C, bis einzelne Zellen
   3. getrennt (5-10 min).
   4. Schließen Sie die Zelltrennung sanft ab, indem Sie mit einer P1000-Pipettierer 3-4 Mal auf und ab pipettieren.
   5. In einem 15-ml-Röhrchen auffangen und PBS (Ca^2+/Mg²⁺ frei) zu 10 mL hinzufügen. Zählen Sie die Zellen.
   6. Pelletieren Sie 10⁶ Zellen und resuspendieren Sie sie in 100 μl Puffer R (im Zellelektroporationskit enthalten, siehe Materialtabelle).
   7. Fügen Sie Plasmid-DNA für die Transfektion hinzu: 4,5 μg transponierbarer Vektor (epB-Bsd-TT-NIL oder epB-Bsd-TT-NIP) und 0,5 μg des piggyBac-Transposase-Plasmids.
   8. Transfektieren Sie mit dem Zellelektroporationssystem (siehe Materialtabelle) gemäß den Herstellerangaben mit folgenden Parametern: 1.200 V Spannung, 30 ms Breite, 1 Impuls. Die Zellen werden in humanem iPSC-Medium, ergänzt mit 10 μM Y-27632 (ROCK-Inhibitor, siehe Materialtabelle), in einer 6 mm matrixbeschichteten Schale ausgesät.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nr. B27	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-093-566	Serumfreies Nahrungsergänzungsmittel für die Erhaltung neuronaler Zellen
Bambanker	Nippon Genetik	NGE-BB02	Zellgefriermedium für Vorläuferzellen von Motoneuronen
CaCl2	Sigma-Aldrich	Nr. C3881	Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen
Corning Matrigel hESC-qualifizierte Matrix	Corning	354277	Rekonstituiertes Basalmembranpräparat aus dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maussarkom. Wird für die Verklebung von iPSC auf Kunststoff- und Glasträgern verwendet
CRYOSTEM ACF GEFRIERMEDIEN	Biologische Industrien	05-710-1E	Gefriermedium für humane iPSCs
Dispase	Gibco	Artikel-Nr.: 17105-041	Reagenz zur schonenden Dissoziation humaner iPSCs
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: D6421-500ML	Basalmedium für die Zellkultur
doxycyclin	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Wird verwendet, um die Expression von Transgenen aus epB-BSD-TT-NIL- und epB-BSD-TT-NIP-Vektoren zu induzieren
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Kommerzielle iPSC-Leitung für den Menschen
GDNF	PreproTech	Nr. 450-10	Neurotropher Faktor aus Gliazellen
Gibco Episomale hiPSC-Linie	Thermo Fisher Scientific	Nr. A18945	Kommerzielle iPSC-Leitung für den Menschen
Hepes	Sigma-Aldrich	Nr. H4034	Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Fördert die Anheftung und das Wachstum von Nervenzellen in vitro
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Nicht-essentielle Aminosäuren. Wird als Ergänzung für Zellkulturmedium verwendet, um das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit zu erhöhen.
Neon 100 μL Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Elektroporations-Kit für Zellen
Neon-Transfektionssystem	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Elektroporationssystem für Zellen
Neurobasales Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049	Basales Medium, das für die langfristige Erhaltung und Reifung neuronaler Zellpopulationen entwickelt wurde, ohne dass eine Astrozyten-Feeder-Schicht erforderlich ist
NutriStem-XF/FF	Biologische Industrien	05-100-1A	Humanes iPSC-Kulturmedium
PBS Ca2+/Mg2+ frei	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: D8537-500ML	Dulbecco's Phosphatpuffer Kochsalzlösung, ohne Calcium, ohne Magnesium
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	Nr. P4333-100ML	Penicillin/Streptomicin-Lösung, die verwendet wird, um eine Kontamination der Zellkultur durch Bakterien zu verhindern.
Y-27632 (ROCK-Inhibitor)	Enzo Biowissenschaften	ALX-270-333-M005	Zellpermeabler selektiver Inhibitor der Rho-assoziierten, Coiled-Coil enthaltenden Proteinkinase (ROCK). Erhöht das Überleben von iPS-Zellen