$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. gRNA-Design für den CRISPR-Verkettungsvektor
HINWEIS: Das Ziel dieses Abschnitts ist es, zu erklären, wie man sich für die beste Targeting-Strategie entscheidet und wie man gRNAs mit spezifischen Überhängen für den CRISPR-Verkettungsvektor entwirft.
- Entwerfen Sie gRNAs für die interessierenden Gene mit einem CRISPR-gRNA-Designwerkzeug Ihrer Wahl. Ein Beispiel finden Sie in der Materialtabelle.
Anmerkung: Wenn es auf ein Paar paraloger Gene abzielt, ist es zwar möglich, eine gRNA pro Gen zu designen, aber es ist ratsam, zwei gRNAs pro Gen zu entwerfen, um die Chancen auf einen doppelten Knockout zu erhöhen (Abbildung 1).
- Stellen Sie sicher, dass die gRNAs nicht die BbsI-Erkennungsstelle enthalten, indem Sie ein Restriktions-Mapping-Tool verwenden (ein Beispiel finden Sie in der Materialtabelle).
- Fügen Sie jedem Oligo spezifische CRISPR-Verkettungsvektor-Überhänge hinzu, wie in Tabelle 1 gezeigt.
>2. Klonierung von gRNAs in den CRISPR-Verkettungsvektor
- Phosphorylierung und Annealing von Oligos
Anmerkung: Dieser Schritt zeigt, wie obere und untere Stränge für jedes gRNA-Oligo geglüht und ihre Enden in einer einzigen Reaktion phosphoryliert werden.
- Bereiten Sie das Reaktionsgemisch für die Phosphorylierung von Oligos und das Glühen von oberen und unteren Strängen auf Eis gemäß den nachstehenden Anweisungen vor.
Anmerkung: Alle Oligos können in einer Reaktion zusammengefasst werden; Im Falle eines 4-gRNA-Verkettungsvektors werden beispielsweise 8 Oligos zusammengelegt.
- Verwenden Sie für 3 Verschreibungspunkte 3,0 μl gRNA Oberstrang (1,0 μl aus jeder gRNA; 10 μM, 1 μL/gRNA), 3,0 μl gRNA Unterstrang (1,0 μl aus jeder gRNA; 10 μM, 1 μL/gRNA), 2,0 μl T4 DNA-Ligase-Puffer (10x), 1,0 μl T4 PNK und fügen Sie H2O bis zu einem Gesamtvolumen von 20,0 μl hinzu.
- Durch Pipettieren gut mischen und in einem Thermocycler mit den folgenden Einstellungen laufen lassen: 37 °C für 30 min, 95 °C für 5 min, herunterfahren auf 25 °C bei 0,3 °C/min, bei 4 °C halten.
- BbsIch schiebe Reaktion
Anmerkung: In diesem Abschnitt werden die vorgeglühten gRNA-Oligos in einem Schritt durch abwechselnde Zyklen von Verdau und Ligation in die entsprechende Position des Verkettungsvektors eingebaut.
- Das Reaktionsgemisch wird 1:100 in DNase/RNase-freiem Wasser verdünnt, um 3 und 4 gRNA-Verkettungsvektoren zu erzeugen.
Anmerkung: Bei der Klonierung von 2 gRNA-Koncatemeren ist dieser Schritt nicht erforderlich.
- Montieren Sie die BbsI Mischreaktion auf Eis, wie unten beschrieben. Fügen Sie ein Negativsteuerelement hinzu, das nur den Vektor enthält.
- Verwenden Sie 100 ng CRISPR-Verkettungsvektor, 10,0 μl Oligogemisch, 1,0 μl BSA-haltigen Restriktionsenzympuffer (10x), 1,0 μl DTT (10 mM), 1,0 μl ATP (10 mM), 1,0 μl BbsI, 1,0 μl T7-Ligase und H2O bis zu einem Gesamtvolumen von 20,0 μl.
- Durch Pipettieren gut mischen und in einem Thermocycler mit den folgenden Einstellungen durchführen: 50 Zyklen für die Klonierung von 3 und 4 gRNA-Konkateneren und 25 Zyklen für 2 gRNA-Verkettungssysteme, beide bei 37 °C für 5 min, 21 °C für 5 min, 15 min bei 37 °C und dann für immer 4 °C halten.
- Exonuklease-Behandlung
Anmerkung: Dieser Schritt wird dringend empfohlen, da er die Effizienz der Klonierung erhöht, indem alle Spuren linearisierter DNA entfernt werden.
- Behandeln Sie die BbsI Shuffling-Reaktion mit einer DNA-Exonuklease (siehe Materialtabelle) wie folgt.
- Nehmen Sie 11,0 μl Ligationsmischung aus dem vorherigen Schritt (2.2.3), fügen Sie 1,5 μl Exonuklease-Puffer (10x), 1,5 μl ATP (10 mM), 1,0 μl DNA-Exonuklease hinzu und erhöhen Sie das Gesamtvolumen mit Wasser auf 15,0 μl. 30 min bei 37 °C inkubieren, gefolgt von 30 min
Anmerkung: Dieser Schritt entfernt alle linearisierten DNA-Reste in der Mischung und erhöht so die Klonierungseffizienz.
- 2 μl des Reaktionsgemisches zur Umwandlung in chemisch kompetente E. coli-Bakterien durch Hitzeschock verwenden.
HINWEIS: Alternativ kann die Reaktion bis zu einer Woche bei -20 °C gelagert werden.
>3. Transfektion von Darmorganoiden durch Elektroporation
HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass dieses Verfahren auf dem von Fujii et al. im Jahr 2015 veröffentlichten Protokoll basiert, mit Anpassung für Dünndarm-Organoidkulturen von Mäusen.
- Vor-Elektroporation
Anmerkung: In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie die Darmorganoide der Maus vor der Elektroporation vorbereitet werden, indem alle Antibiotika und konditionierten Medien aus dem Nährmedium entfernt werden. Dadurch werden mögliche toxische Wirkungen bei der Elektroporation vermieden.
- Am Tag 0 der Transfektion werden die Organoide im Verhältnis 1:2 gespalten
HINWEIS: Darm-Organoidkulturen können durch die Durchführung einer Kryptenisolierung gemäß zuvor festgelegten Protokollen gewonnen werden. Bitte beziehen Sie sich auf Tabelle 2 für alle Medienzusammensetzungen.
- Bei der Spaltung von Organoiden für die Elektroporation ist die Aussaat von mindestens 6 Vertiefungen einer 48-Well-Platte pro Transfektion zu säen.
- Die Organoide werden in 20 μL-Basalmatrixtropfen gesät und in WENR + Nic Medium (Wnt + EGF + Noggin + R-Spondin + Nicotinamid) bei 37 °C, 5% CO2 in einem befeuchteten Inkubator (wie zuvor beschrieben) gezüchtet.
- Wechseln Sie am Tag 2 das Medium, indem Sie WENR+Nic durch 250 μl EN (EGF + Noggin) + CHIR99021 (Glykogensynthase-Kinase-3-Hemmer) + Y-27632 (ROCK-Inhibitor) ohne Antibiotika ersetzen (siehe Tabelle 2).
HINWEIS: In allen Schritten beträgt die Menge des Mediums, die in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte gegeben wird, 250 μl.
- An Tag 3 wird das Organoidmedium auf EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25 % v/v Dimethylsulfoxid (DMSO) ohne Antibiotika umgestellt.
- Vorbereitung der Zellen
Anmerkung: Hier beschreiben wir, wie Organoide durch mechanische und chemische Dissoziation in kleine Zellcluster fragmentiert werden können. Diese Schritte sind entscheidend für den Erfolg des Verfahrens.
- Brechen Sie an Tag 4 die Matrizenkuppeln des Untergeschosses mit einer 1-ml-Pipettenspitze auf und übertragen Sie die Organoide in ein 1,5-ml-Röhrchen. Poolinhalt von vier Vertiefungen einer 48-Well-Platte in ein Rohr.
- Zerlegen Sie Organoide mechanisch in kleine Fragmente, indem Sie mit einer P200-Pipette etwa 200 Mal auf und ab pipettieren. Zentrifugieren Sie bei Raumtemperatur, 5 min bei 600 x g.
- Entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml einer rekombinanten Protease in Zellkulturqualität (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie maximal 5 Minuten bei 37 °C und überprüfen Sie dann einen 50-μl-Probentropfen unter einem inversen Lichtmikroskop mit einem 4-fach-Objektiv.
Anmerkung: Cluster von 10-15 Zellen sind wünschenswert, da dies das Überleben der Zellen nach der Elektroporation erhöht.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein niedrig bindendes 15-ml-Röhrchen und stoppen Sie die Dissoziation durch Zugabe von 9 mL Basalmedium ohne Antibiotika (siehe Tabelle 2). Zentrifugieren Sie bei Raumtemperatur 5 min bei 600 x g, verwerfen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL reduziertem Serummedium (siehe Materialtabelle).
- Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einer Bürkerkammer und verwenden Sie mindestens 1 x 105 Zellen pro Elektroporationsreaktion. Geben Sie 9 mL reduziertes Serummedium in das 15 mL Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei Raumtemperatur, 3 min bei 400 x g.
- Elektroporation
Anmerkung: In den folgenden Abschnitten finden Sie Anweisungen, wie Sie die Elektroporation durchführen und die Organoide anschließend wiederherstellen können.
- Entfernen Sie den gesamten Überstand und suspendieren Sie das Pellet in einer Elektroporationslösung (siehe Materialtabelle). Geben Sie eine Gesamtmenge von 10 μg DNA in die Zellsuspension und fügen Sie Elektroporationslösung bis zu einem Endvolumen von 100 μl hinzu und halten Sie das Zell-DNA-Gemisch auf Eis. Verwenden Sie CRISPR-Concatamer-Vektoren in Kombination mit einem Cas9-Expressionsplasmid (z.B. Addgene #41815) im Verhältnis 1:1.
Anmerkung: Das Gesamtvolumen der zugegebenen DNA sollte kleiner oder gleich 10 % des Gesamtreaktionsvolumens sein.
- Fügen Sie eine separate Transfektionsmischung hinzu, die ein GFP-Plasmid enthält, um die Transfektionseffizienz zu bewerten (z. B. pCMV-GFP, Addgene #11153 oder ein generisches GFP-exprimierendes Plasmid).
- Geben Sie das Zell-DNA-Gemisch in die Elektroporationsküvette und legen Sie es in die Elektroporatorkammer. Messen Sie die Impedanz, indem Sie den entsprechenden Knopf am Elektroporator drücken, und stellen Sie sicher, dass sie 0,030-0,055 kΩ beträgt. Führen Sie die Elektroporation gemäß den in Tabelle 3.
gezeigten Einstellungen durch.
Anmerkung: Wenn der Impedanzwert außerhalb des zulässigen Bereichs liegt, stellen Sie das Lösungsvolumen in der Küvette ein.
- Geben Sie 400 μl Elektroporationspuffer + Y-27632 in die Küvette und geben Sie dann alles in ein 1,5-ml-Röhrchen. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren, damit sich die Zellen erholen können, und anschließend 3 min bei Raumtemperatur bei 400 x g schleudern.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 20 μl/Vertiefung der Kellermatrix. Säen Sie ca. 1 x 104 bis 1 x 105 Zellen pro Well in einer 48-Well-Platte und fügen Sie EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25 % v/v DMSO-Medium hinzu. Inkubieren bei 37 °C.
- Wechseln Sie am Tag 5 das Medium auf EN + CHIR99021 + Y-27632 und überprüfen Sie die Transfektionseffizienz, indem Sie die GFP-Expression beobachten (Abbildung 2). Halten Sie die Organoide bei 37 °C und aktualisieren Sie EN + CHIR99021 + Y-27632 nach 2 Tagen auf Medium.
- An Tag 9 das Medium auf WENR + Nic + Y-27632 umstellen und bei 37 °C inkubieren.
Anmerkung: Y-27632 kann nach 7-10 Tagen (an den Tagen 16-19) entfernt werden.
| Kassette 1 | Kassette 2 | Kassette 3 | Kassette 4 |
| Sequenz (5′-3′) | CACCGG[gRNA1]GT | ACCGG[gRNA2]G | CCGG[gRNA3] | ACACCGG[gRNA4]GTT |
| Sequenz (5′-3′) | TAAAAC[RC-gRNA1]CC | AAAAC[RC-gRNA2]C | AAAC[RC-gRNA3] | CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG |
Tabelle 1: Überhänge für jede Kassette des CRISPR-Verkettungsvektors.
| Basales Medium | | Kommentare |
| 4 Wochen bei 4 °C lagern | | |
| Zellkulturmedium | 500 mL | Siehe Werkstofftabelle |
| L-Glutamin | 100x 5 mL | |
| Puffermittel 1 M | 5 mL | Siehe Werkstofftabelle |
| Penicillin Streptomycin | 100x 5 mL | |
| WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rspondin + Nicotinamid) | | |
| 2 Wochen bei 4 °C lagern | | |
| Basales Medium | bis zu 50 mL | |
| Nahrungsergänzungsmittel ohne Serum für neuronale Zellen (50x) | 1 mL | Siehe Werkstofftabelle |
| Nahrungsergänzungsmittel ohne Serum für neuronale Zellen (100x) | 500 μL | Siehe Werkstofftabelle |
| n-Acetylcystein (500 mM) | 125 μL | |
| EGF für Maus (100 μg/ml) | ca. 25 μl | |
| Maus Noggin (100 μg/ml) | 50 μL | |
| R-Spondin konditioniertes Medium | 5 mL | |
| Wnt3a konditioniertes Medium | ca. 25 mL | |
| Nicotinamid (1 M) | 250 μL | |
| EN + CHIR + Y-27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y-27632) | | |
| 2 Wochen bei 4 °C lagern | | |
| Basalmedium ohne Penicillin Streptomycin | bis zu 20 mL | |
| Nahrungsergänzungsmittel ohne Serum für neuronale Zellen (50x) | 400 μL | Siehe Werkstofftabelle |
| Nahrungsergänzungsmittel ohne Serum für neuronale Zellen (100x) | 200 μL | Siehe Werkstofftabelle |
| n-Acetylcystein (500 mM) | 50 μL | |
| EGF für Maus (100 μg/ml) | 10 μL | |
| Maus Noggin (100 μg/ml) | ca. 20 μl | |
| Y-27632 (10 μM) | ca. 20 μl | |
| CHIR99021 (8 μM) | 10 μL | |
| EN (EGF + Noggin) | | |
| 4 Wochen bei 4 °C lagern | | |
| Basales Medium | bis zu 50 mL | |
| Nahrungsergänzungsmittel ohne Serum für neuronale Zellen (50x) | 1 mL | Siehe Werkstofftabelle |
| Nahrungsergänzungsmittel ohne Serum für neuronale Zellen (100x) | 500 μL | Siehe Werkstofftabelle |
| n-Acetylcystein (500 mM) | 125 μL | |
| EGF für Maus (100 μg/ml) | ca. 25 μl | |
| Maus Noggin (100 μg/ml) | 50 μL | |
Tabelle 2: Zusammensetzung organoider Medien.
| Poren-Puls | Impuls übertragen |
| Spannung | 175V | 20V |
| Pulslänge | 5 ms | 50 ms |
| Puls-Intervall | 50 ms | 50 ms |
| Anzahl der Impulse | arabische Ziffer | 5 |
| Abbaurate | 10 % | 40% |
| Polarität | + | +/- |
Tabelle 3: Elektroporationseinstellungen.
