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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Installation von Software
- Befolgen Sie die Anweisungen, um die Software von https://github.com/bsbrl/Autoinjector zu installieren.
>2. Vorbereitung von Reagenzien und Pipetten
- Agarose: Bereiten Sie 3 % Agarose her, indem Sie 3 g Weitbereichs-Agarose und 3 g Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in 100 ml PBS in Zellkulturqualität in zwei separaten 200-ml-Glasflaschen separat auflösen. Bei Raumtemperatur bis zu 3 Monate lagern.
- Tyrode-Lösung: 1 g Natriumbicarbonat und Tyrodesalz (verwenden Sie den Inhalt der gesamten Flasche) und 13 ml 1 M HEPES in 1 l destilliertem Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Die Lösung wird durch einen 0,2 μm Filter mit Flaschenaufsatz filtriert.
- Schnittkulturmedium (SCM): Geben Sie 10 ml Rattenserum, 1 ml 2 mM Glutamin, 1 ml Penicillin-Streptomycin (100x), 1 ml N-2-Supplement (100x), 2 mL B27-Supplement (50x) und 1 mL HEPES-Puffer (pH 7,3) in 84 mL Neurobasalmedium. Aliquotieren Sie 5 mL SCM in 15 mL Röhrchen. Bei -20 °C lagern.
- CO2-unabhängiges Mikroinjektionsmedium (CIMM): Bereiten Sie 5x DMEM-modifizierte Low-Glucose-Lösung (ohne Phenolrot) vor, indem Sie das Pulver in 200 mL destilliertem Wasser auflösen. Filtrieren Sie die Lösung durch einen 0,2 μm Filter mit Flaschenaufsatz (für das DMEM-Pulver verwenden Sie den Inhalt der gesamten Flasche). Zur Herstellung von 100 ml CIMM mischen Sie 20 ml 5x DMEM-modifizierte Lösung, 1 ml HEPES-Puffer, 1 ml N2-Supplement (100x), 2 mL B27-Supplement (50x), 1 mL Penicillin-Streptomycin (100x), 1 mL 2 mM Glutamin und 74 mL destilliertes Wasser. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C.
- Rekonstitutionspuffer: Bereiten Sie den Rekonstitutionspuffer vor, indem Sie 262 mM NaHCO₃, 0,05 N NaOH, 200 mM HEPES in destilliertem Wasser auflösen. Sterilisieren Sie die Lösung durch Filtration durch ein 0,22-μm-Filtersystem mit Flaschenaufsatz in eine sterile Glasflasche. Aliquot 500 μl Rekonstitutionspuffer in luftdichte Mikrozentrifugenröhrchen. Bei 4 °C lagern.
- Mikroinjektionsfarbstoff: Das fluoreszenzmarkierte Dextran wird in RNase-freiem destilliertem Wasser (Endkonzentration 10 μg/μL) gelöst. 5 μl Aliquots vorbereiten und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
- Ziehen Sie die Mikroinjektionspipetten mit dem Mikropipettenzieher aus Borosilikatglaskapillaren (1,2 mm Außendurchmesser, 0,94 mm Innendurchmesser). Schützen Sie die Pipetten vor Staub. Bewahren Sie Pipetten nicht länger als 2–3 Tage auf. Für dieses Experiment waren die Zugparameter HEAT: Rampentemperatur +1 – 5; ZUG: 100; VEL: 110; DEL: 100. HEAT und VEL sind die Parameter, die die Form und Größe der Pipette am meisten beeinflussen.
Anmerkung: Die optimale Mikroinjektionspipette hat eine lange und flexible Spitze, um Zellschäden während der Mikroinjektion zu vermeiden.
>3. Vorbereitung von Gewebeschnitten
- Schmelzen Sie die 3%ige Agarose mit einem Weitbereichsbereich in der Mikrowelle, bevor Sie das Hirngewebe dissektionieren. Lassen Sie die Agarose nicht festigen, indem Sie sie vor dem Einbetten in einem Wasserbad bei 37 °C aufbewahren. Stellen Sie sicher, dass die Pipetten vor Staub geschützt sind. Bewahren Sie Pipetten nicht länger als 2–3 Tage auf.
- Tauen Sie ein Aliquot von SCM auf und erwärmen Sie 10–12 mL CIMM und 20 mL Tyrode-Lösung mit einem Wasserbad auf 37 °C.
- Mischen Sie den fluoreszierenden Tracer (Dextran-3000 oder Dextran-10000-Alexa, konjugiert; Endkonzentration 5–10 μg/μl) mit der anderen Chemikalie(n), die injiziert werden sollen. Die Mikroinjektionslösung bei 16.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand auffangen und in ein neues Röhrchen umfüllen. Bewahren Sie die Mikroinjektionslösung bis zur Verwendung auf Eis auf.
- Verwenden Sie die Köpfe von E13.5–E16.5 Mausembryonen, um organotypische Gewebeschnitte des Telencephalons herzustellen. Entferne die Haut und öffne den Schädel mit der Pinzette, indem du dich entlang der Mittellinie bewegst. Präparieren Sie das embryonale Gehirn aus dem offenen Schädel und entfernen Sie die Hirnhäute, die das Hirngewebe bedecken, beginnend mit der ventralen Seite des Gehirns. Lassen Sie das sezierte ganze Gehirn in Tyrodes Lösung auf einem 37 °C heißen Heizblock.
Anmerkung: Alle in 3.4 beschriebenen Präparierschritte müssen in vorgewärmter Tyrode-Lösung durchgeführt werden.
- Gießen Sie die breite Palette geschmolzener Agarose in eine Einweg-Einbettform. Wenn die Agarose auf 38–39 °C abgekühlt ist, übertragen Sie das Gehirn (maximal 4) vorsichtig mit einer Pasteurpipette hinein. Verwenden Sie für diesen Schritt immer Schnittspitzen.
- Rühren Sie die Agarose entweder mit einem Spatel oder einer Dumont #1 Pinzette um das Gewebe herum, ohne das Gewebe zu berühren. Die Agarose bei Zimmertemperatur fest werden lassen. Sobald sich die Agarose verfestigt hat, schneiden Sie die überschüssige Agarose, die das Gewebe umgibt, ab.
- Füllen Sie das Pufferfach mit PBS. Richten Sie das Gehirn mit der rostro-kaudalen Achse des Gewebes senkrecht zum Tablett aus (verwenden Sie als Orientierungspunkt die Riechkolben, die den rostralsten Teil des Gehirns darstellen). Schneiden Sie 250 μm Scheiben mit einem Vibratom
.
- Füllen Sie eine 3,5 cm große Petrischale mit 2 ml vorgewärmtem Medium. Mit einer Pasteur-Plastikpipette die Scheiben (10–15) in diese Schale geben. Sobald Sie fertig sind, schieben Sie die Petrischale mit den Scheiben in den Scheibenkultur-Inkubator. Die Scheiben bis zur Verwendung bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 40 % O2 / 5 % CO2 / 55 % N2 aufbewahren.
>4. Mikroinjektion
- Schalten Sie den Computer, das Mikroskop, die Mikroskopkamera, die Manipulatoren, das Druckgerät und den Drucksensor ein. Laden Sie die Anwendung, indem Sie auf die Datei "launchapp.py" im Hauptordner klicken, die Sie von GitHub heruntergeladen haben, und geben Sie die Geräteeinstellungen im Popup-Fenster an (siehe Schritt 1.1 für Installationsanweisungen).
- Erzeugen Sie einen Druck nach außen, um unerwünschtes Verstopfen zu verhindern, bevor Sie die Pipette in die Lösung eintauchen. Um Druck auf die Pipette auszuüben, schieben Sie den Kompensationsdruckbalken auf 24–45 % und klicken Sie auf Werte einstellen. Stellen Sie anschließend den Druck auf einen ausreichenden Druck ein, indem Sie den mechanischen Druckventilknopf auf 1–2 PSI (69–138 mbar) drehen, wie vom Drucksensor angezeigt.
- Die Scheiben in eine 3,5 cm große Petrischale mit 2 ml vorgewärmtem CIMM geben. Legen Sie die zu mikroinjizierenden Scheiben in die Mitte der Petrischale. Übertragen Sie die Petrischale in die vorgeheizte (37 °C) Mikroinjektionsstufe.
- Befüllen Sie die Mikroinjektionspipette mit 1,4–1,6 μl Mikroinjektionslösung (aus Schritt 3.3) mit einer Kunststoffpipette mit langer Spitze. Führen Sie die Mikroinjektionspipette in den Pipettenhalter ein.
- Bringen Sie die Scheibe mit der niedrigsten Vergrößerung am Mikroskop in den Fokus und führen Sie die Mikropipette so auf dieses Sichtfeld (FOV), dass sie auf derselben Ebene wie das Scheibenziel fokussiert wird. Schalten Sie den Ausgang des Mikroskops auf die Kamera um, um das Sichtfeld in der Anwendung zu sehen.
- Klicken Sie auf die Vergrößerungsschaltfläche oben links in der Benutzeroberfläche, um die Gerätekalibrierung zu starten. In einem Fenster werden Sie aufgefordert, die Vergrößerung auszuwählen. Wählen Sie die 10-fache Vergrößerung oder die Vergrößerung, auf die das Objektiv eingestellt ist (z. B. 4x, 10x, 20x, 40x) und drücken Sie OK. Die Software geht davon aus, dass die interne Objektivlinse 10x ist (die gebräuchlichste Vergrößerung der Objektivlinse).
- Fokussieren Sie die Pipettenspitze mit dem mikrometrischen Rad des Mikroskops neu und klicken Sie mit dem Cursor auf die Pipettenspitze. Drücken Sie anschließend die Taste Schritt 1.1 und drücken Sie OK im Popup-Fenster. Die Pipette bewegt sich in Y-Richtung. Klicken Sie auf die Spitze der Pipette und drücken Sie die Taste Schritt 1.2. Geben Sie abschließend 45 in das Feld Pipettenwinkel ein und drücken Sie die Taste Winkel einstellen.
- Geben Sie die gewünschten Parameter in das Bedienfeld für die automatische Mikroinjektion ein. Für die Mikroinjektion in apikale Vorläuferzellen ist der Injektionsabstand auf 20–40 μm und die Tiefe auf 10–15 μm einzustellen. Für die Mikroinjektion in Neuronen stellen Sie den Injektionsabstand 30–40 μm von der basalen Seite und die Injektionstiefe auf 10–30 μm ein, je nachdem, worauf es abzielt. Stellen Sie die Geschwindigkeit immer auf 100 % ein. Klicken Sie auf Werte festlegen.
Anmerkung: Die Annäherungsdistanz ist die Entfernung, die die Pipette aus dem Gewebe zieht, bevor sie zur nächsten Injektionsdistanz übergeht, die Tiefe ist die Tiefe in das Gewebe, in die die Mikroinjektion geht, der Abstand entlang der Linie zwischen aufeinanderfolgenden Injektionen, die Geschwindigkeit ist die Geschwindigkeit der Pipette in μm/s.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Kante zeichnen und ziehen Sie den Cursor entlang der gewünschten Trajektorie im Popup-Fenster, um die Trajektorie der Injektion zu definieren. Für die Mikroinjektion von Vorläuferstammzellen wird die ventrale Seite der Telencephalon-Oberfläche anvisiert. Bringen Sie die Pipette an den Anfang der Linie und klicken Sie auf die Spitze der Pipette. Klicken Sie auf Trajektorie ausführen, um die Mikroinjektion zu starten. Wiederholen Sie diesen Schritt für jede Zielinjektionsebene (in der Regel für 3-4 Ebenen mit 40-75 Injektionen pro Ebene).