Proteinreinigung auf Basis der Anionenaustauschchromatographie: Eine Trenntechnik zur Isolierung eines Proteins von Interesse aus dialysiertem bakteriellem Lysat auf der Grundlage der Nettoladung

Zusammenfassung

Quelle: Fuehner, S., et al. Reinigung von menschlichem S100A12 und seinen ioneninduzierten Oligomeren zur Stimulation von Immunzellen J. Vis. exp. (2019)

In diesem Video demonstrieren wir eine Anionenaustauschchromatographie-Technik zur Aufreinigung von menschlichem Kalzium-bindendem Protein S100A12 basierend auf der Netto-Oberflächenladung des Proteins aus einer Escherichia coli-Kultur.

Protokoll

1. Protein-Aufreinigung

1. Anionenaustausch-Chromatographie
   1. Dialyse
      Bereiten Sie den
      1. Anionenaustauschchromatographie-Puffer A (AIEX) vor, indem Sie 20 mM Tris, 1 mM EDTA und 1 mM Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-Tetraessigsäure (EGTA) in entionisiertem Wasser auflösen und den pH-Wert mit HCl auf 8,5 einstellen. Für die Dialyse 2 x 5 L und für die Chromatographie 2x 1 L AIEX-Puffer A.
         Anmerkung: Das Dialysatvolumen sollte etwa dem 100-fachen des Probenvolumens entsprechen. Alle für die Chromatographie verwendeten Puffer sollten filtriert (0,45 μm oder kleiner) und entgast werden (z. B. durch Ultraschallbad oder Vakuumentgasung).
      2. Schneiden Sie den Dialyseschlauch (Molekulargewichts-Cut-off [MWCO]: 3,5 kDa) in eine geeignete Länge mit zusätzlichem Platz für Luft, um den Auftrieb der Probe über dem rotierenden Rührstab zu gewährleisten.
         Anmerkung: Glycerin konserviert die Membran und muss vor der Verwendung entfernt werden.
      3. Um die Viskosität der geklärten Proteinlösung zu verringern, verdünnen Sie die Lösung mit 25 mL AIEX-Puffer A, um die anschließende Anwendung auf der Chromatographiesäule zu erleichtern. Befestigen Sie den ersten Verschluss an den Schlauch, laden Sie die Probe in die Membran und befestigen Sie den zweiten Verschluss mindestens 1 cm vom oberen Ende des Schlauchs entfernt.
      4. Stellen Sie den 5-Liter-Behälter mit AIEX-Puffer A auf eine Rührplatte, fügen Sie einen Rührstab hinzu und füllen Sie die Membran mit Proteinlösung. Passen Sie die Geschwindigkeit an, um die Probe zu drehen, indem Sie Interferenzen mit dem rotierenden Rührstab vermeiden. Dialysieren Sie 12-24 Stunden bei 4 °C, ersetzen Sie dann den Dialysatpuffer (AIEX-Puffer A) durch ein frisches, vorgekühltes Präparat und fahren Sie für mindestens weitere 4 Stunden fort. Die dialysierte Proteinlösung wird in ein 50-ml-Röhrchen überführt und durch eine 0,45-μm-Filtereinheit filtriert.
         Anmerkung: Lagerung möglich.
   2. Chromatographie
      1. Starten Sie das Flüssigchromatographie-System (FPLC) mit allgemeiner Wartung, schließen Sie die Säulenpuffer AIEX A und AIEX B (AIEX-Puffer A mit 1 M NaCl) und die Anionenaustauscherharz-haltige Säule an. Allgemeine chromatographische Parameter finden Sie in Tabelle 1.
         Anmerkung: Puffer, Säule und FPLC-Ausrüstung sollten vor Beginn des Laufs auf die gleiche Temperatur ausgeglichen werden (siehe chromatographische Parameter in Tabelle 1, Tabelle 2).
      2. Äquilibrieren Sie die Säule mit AIEX-Puffer A, laden Sie anschließend die Probe auf die Säule und eluieren Sie die Proteine mit einem linearen Gradienten von 0 % auf 100 % High-Salt-Puffer (AIEX B). In Tabelle 2 finden Sie ein detailliertes Methodenprotokoll
      .
      3. Sammeln Sie 2 ml-Fraktionen während der Elution und analysieren Sie 10 μl jeder Fraktion auf einer Coomassie-gefärbten 15%igen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Bündeln Sie die Fraktionen, die S100A12 Protein für die Dialyse enthalten.
         Anmerkung: Das Molekulargewicht von S100A12 beträgt 10.575 Da.

Ergebnisse

Tabelle 1: Detaillierte Informationen zu den angewandten Parametern der Anionenaustauschchromatographie.

Bettvolumen (CV)	75 mL
Monitor	Extinktion bei 280 nM
Druck Max	3 bar
Spalten-Puffer A	20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,5
...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
25% HCl	Carl Roth	X897.1
4− 20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gele	BioRad	4561093
Coomassie Briliant Blue R250 Entfärbungslösung	BioRad	1610438
Coomassie Briliant Blue R250 Färbelösung	BioRad	1610436
EDTA Dinatriumsalz-Dihydrat	Carl Roth	8043.1
EGTA	Carl Roth	3054.3
Q Sepharose Fast Flow	GE Healthcare	17-0510-01	Harz für die Anionenaustauschchromatographie
Natriumchlorid (NaCl)	Carl Roth	3957.2
Natriumhydroxid	Carl Roth	P031.1
Tris Base	Carl Roth	4855.3
0.45 µ m Spritzenvorsatzfilter	Merck	SLHA033SS
5 L Messbecher	Carl Roth	CKN3.1
50 mL konische Zentrifugenröhrchen	Corning	430829
Verschlüsse für Dialyseschläuche	Spektrum	132738
Fraktionssammlerröhrchen 5 mL	Greiner	115101
Spectra/Por Dialysemembran (3,5 kDa)	Spektrum	132724
Steritop Filtereinheit	Merck	SCGPT01RE
Ä KTA Luftreiniger UPC 10	GE Healthcare		FPLC-System
Fraktionssammler	GE Healthcare	Frac-920
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658000EDU
NanoPhotometer	Implen	P330
pH-Messgerät	Knick	765