Calciumabhängige hydrophobe Interaktionschromatographie: Eine Technik zur Aufreinigung von Calcium-bindenden Proteinen auf der Grundlage hydrophober Wechselwirkungen

Zusammenfassung

Quelle: Fuehner, S., et al., Reinigung von menschlichem S100A12 und seinen ioneninduzierten Oligomeren zur Stimulation von Immunzellen. J. Vis. Exp. (2019).

In diesem Video demonstrieren wir die Aufreinigung von Calcium-bindendem Protein aus einem dialysierten Zelllysat durch calciumabhängige hydrophobe Interaktionschromatographie. Die Calcium-bindenden Proteine legen bei der Bindung an Calcium einen hydrophoben Bereich frei, was die Interaktion mit einer hydrophoben Gruppe auf dem Harz erleichtert. Später werden diese Proteine mit einem Kalziumchelator EDTA eluiert, der die Wechselwirkung umkehrt.

Protokoll

1. Calciumabhängige hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC)

1. Dialyse
   1. Dialysieren Sie die Proteinlösung gegen 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,5
2. Chromatographie
   1. Bereiten Sie 1 l Chromatographiepuffer HIC A vor, indem Sie 20 mM Tris, 140 mM NaCl und 25 mM CaCl2 in deionisiertem Wasser auflösen und den pH-Wert auf 7,5 einstellen. Für HIC-Puffer B werden 20 mM Tris, 140 mM NaCl und 50 mM EDTA gelöst. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 ein und filtern und entgasen Sie die Puffer. CaCl2 bis zu einer Endkonzentration von 25 mM in die Probe geben und durch 0,45 μm filtrieren. HIC-Puffer und Probe auf 4 °C (Säulentemperatur) äquilibrieren.
   2. Starten Sie das Flüssigchromatographie-System mit allgemeiner Wartung, schließen Sie die Säulenpuffer HIC A und B an die Säule an. Weitere chromatographische Parameter finden Sie in Tabelle 1.
   3. Äquilibrieren Sie die Säule, laden Sie die Probe und verlängern Sie den Block "Ungebundene Probe waschen", bis das UV-Signal wieder den Ausgangswert erreicht. Beginnen Sie dann die Elution mit einem Calciumchelator, der Puffer (EDTA) enthält. In Tabelle 2 finden Sie ein detailliertes Methodenprotokoll.
      Anmerkung: Frühere Experimente haben gezeigt, dass ein Überschuss an Kalzium für die Bindung von S100A12 an das Chromatographieharz von Vorteil zu sein scheint.
   4. Sammeln Sie Peakfraktionen von 2 mL und analysieren Sie 10 μl jeder Fraktion auf einer Coomassie-gefärbten 15 % SDS-PAGE. Pools reine S100A12 Fraktionen und dialysieren gegen Hepes-gepufferte Kochsalzlösung (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,0).
      Anmerkung: Der Extinktionskoeffizient der monomeren S100A12 beträgt 2980 M-1 cm-1
   .

Ergebnisse

Tabelle 1: Detaillierte Informationen zu den angewandten Parametern der hydrophoben Interaktionschromatographie.

Block	Volumen	Puffer	Steckdose
Gleichgewicht	1−2-spaltige Volumina (CVs)	ein	Abfall
B...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
chemisch
EDTA-Dinatriumsalz-Dihydrat	Carl Roth	Nr. 8043.1
Phenylsepharose High Performance	GE Gesundheitswesen	Artikel-Nr.: 17-1082-01	Harz für die hydrophobe Interaktionschromatographie
Natriumchlorid (NaCl)	Carl Roth	3957,2
Natriumhydroxid	Carl Roth	Nr. P031.1
Tris Basis	Carl Roth	4855,3
25% HCl	Carl Roth	X897.1
Calciumchlorid-Dihydrat	Carl Roth	5239,1
Laborbedarf
0,45 μm Spritzenvorsatzfilter	Merck	SLHA033SS
14 mL Röhrchen mit rundem Boden	Bd	352059
2 L Erlenmyer-Flasche	Carl Roth	LY98.1
Fraktionssammelröhrchen 5 mL	Greiner	115101
Spectra/Por Dialysemembran (3,5 kDa)	Spektrum	132724
Steritop Filteranlage	Merck	SCGPT01RE
Ausrüstung
Fraktions-Sammler	GE Gesundheitswesen	Frac-920