Proteinreinigung auf Basis der Nickel-Affinitätschromatographie: Eine Technik zur Aufreinigung von Polyhistidin-markierten rekombinanten Proteinen aus bakteriellem Zelllysat

Zusammenfassung

Quelle: Pokhrel, A. et al. Ein Aufreinigungs- und In-vitro-Aktivitätsassay für eine (p)ppGpp-Synthetase aus Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (2018)

In diesem Video demonstrieren wir die Nickel-Affinitätschromatographie-Technik zur Aufreinigung von Histidin-markierten Pyrophosphokinase-Enzymen aus Clostridium difficile-Bakterien.

Protokoll

1. Proteinaufreinigung durch Nickel-Affinitätschromatographie

1. Reinigen Sie das Protein mit 1 ml Nickel-Nitriloessigsäure (Ni-NTA)-Harz auf einer Schwerkraftsäule.
   1. Am Tag vor der Anwendung die Säule über Nacht bei 4 °C mit 2 mL Äquilibrierungspuffer äquilibrieren (10 mM Tris-HCl pH 7,79, 300 mM NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, 0,5 mg/ml Lysozym, 5 mM MgCl₂, 10 mM Imidazol, 0,25 mM DTT, 5 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), 10 % Glycerin).
   2. Am nächsten Tag die Säule vor dem Laden des geklärten Lysats von 4 °C auf RT bringen und ~2–3 h.
      stehen lassen Anmerkung: Es ist entscheidend, die Säule in ein thermisches Gleichgewicht zu bringen, um die Bildung von Luftblasen in der Säule zu vermeiden.
   3. Resuspendieren Sie das Pellet im Lysepuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,8, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄, 10 % Glycerin, 0,5 mg/ml Lysozym, 10 mM Imidazol, 0,25 mM DTT und 5 mM PMSF).
   4. Beschallen Sie Zellen auf Eis für 8 x 10 s Intervalle und pausieren Sie 30 s zwischen den Impulsen.
   5. Das Lysat wird durch Zentrifugation bei 3.080 x g für 30 min bei 4 °C mit einer Mikrozentrifuge geklärt.
   6. Bereiten Sie das Lysat mit gleichen Volumina Lysepuffer vor, tragen Sie dann das vorbereitete geklärte Lysat auf die Säule auf und sammeln Sie den Durchfluss.
   7. Tragen Sie erneut geklärten Lysatdurchfluss auf die Säule auf und sammeln Sie den sekundären Durchfluss.
   8. Waschen Sie die Säule mit Waschpuffer 1 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄, 30 mM Imidazol, 10% Glycerin). Sammeln Sie den Flow-Through.
      HINWEIS: Die Aufnahme von 5 mM MgCl₂ in die Wasch- und Elutionspuffer ist wichtig für die enzymatische Aktivität des gereinigten Proteins.
   9. Waschen Sie die Säule mit Waschpuffer 2 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄ und 50 mM Imidazol).
   10. Sammeln Sie den Durchfluss.
   11. 2 mL Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, 10% Glycerin und 75 mM Imidazol) auftragen. Der Durchfluss wird in zwei Fraktionen zu je 1 ml aufgefangen.
       Anmerkung: Die Säule nach diesem Schritt kann in einem Äquilibrierungspuffer bei 4 °C gelagert werden, wenn das gleiche Protein im nächsten Aufreinigungsassay aufgereinigt wird. Die Säule kann bei sachgemäßer Lagerung bis zu 3 Mal verwendet werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ni-NTA-Harz	G Biowissenschaften	Tel.: 786-940/941
Pierce Einweg-Schwerkraftsäulen, 10 mL	Thermo Scientific	Artikel-Nr.: 29924
1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 Dialysegerät (MWCO: 20-kD)	Spektrum	G235033
Ultraschall-Prozessor	Sonics	VC-750
Mikrozentrifuge mit D3024/D3024R Rotor	Scilogex