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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Extraktion der gesamten nicht-kovalenten gebundenen Lipide aus Mykobakterien (Abbildung 1)
- 0,2 g Mykobakterien von einem festen Medium zerkratzen und in ein Glasröhrchen mit einem Schraubverschluss aus Polytetrafluorethlen (PTFE) geben. Eine Lösung bestehend aus 5 mL Chloroform und 10 mL Methanol (Chloroform:Methanol, 1:2) hinzufügen.
Anmerkung: Bei der Verwendung organischer Lösungsmittel sollte nur ein Glasbehälter verwendet werden. Es sind keine Plastikbehälter erlaubt. Darüber hinaus werden PTFE-Liner-Schraubverschlüsse für Flaschen benötigt.
Vorsicht: Chloroform ist ein potenziell giftiger und äußerst gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
Vorsicht: Methanol ist ein potenziell giftiger und äußerst gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
- Lassen Sie das Röhrchen über Nacht unter ständigem Rühren, um nicht-kovalent verknüpfte Lipide von der Zelloberfläche der Mykobakterien zu extrahieren.
Anmerkung: Wenn keine orbitale Schüttelplattform zur Verfügung steht, kann das konstante Rühren so oft wie möglich durch periodisches manuelles Rühren ersetzt werden.
- Decken Sie einen Glastrichter mit einem Filterpapier ab, filtern Sie die organischen Lösungsmittel und sammeln Sie sie in einem Glasröhrchen.
- Verwenden Sie ein Stickstoffgasflussmittel, um die flüssige Phase im Rohr zu verdampfen. Füllen Sie das Röhrchen mit Stickstoffgas, decken Sie es ab und lagern Sie es bei 4 °C.
Anmerkung: Schließen Sie eine Pasteurpipette aus Glas an den Stickstoffgasstrom an, um das gewünschte Röhrchen gezielt zu verdampfen. Bewahren Sie das Rohr zusätzlich in einem Trockenblockheizer für Rohre bei 37 °C auf. Wenn das Lösungsmittel verdampft ist, füllen Sie das Rohr mit Stickstoffgas, bevor Sie es schließen.
- Geben Sie 15 ml einer Lösung von Chloroform:Methanol (2:1) zu den Zelltrümmern. Lassen Sie das Röhrchen über Nacht unter ständigem Rühren, um nicht-kovalent verknüpfte Lipide von der mykobakteriellen Zelloberfläche zu extrahieren.
Anmerkung: Wenn keine orbitale Schüttelplattform zur Verfügung steht, kann das konstante Rühren so oft wie möglich durch periodisches manuelles Rühren ersetzt werden.
- Lassen Sie die Mischung 1 h ruhen. Mit einer Pasteur-Pipette die organischen Lösungsmittel zurückgewinnen. Decken Sie einen Glastrichter mit einem Filterpapier ab, filtern Sie die organischen Lösungsmittel und sammeln Sie sie in demselben Glasröhrchen, das zuvor in Schritt 1.3 verwendet wurde. Verwenden Sie ein Stickstoffgasflussmittel, um die flüssige Phase im Rohr zu verdampfen. Füllen Sie das Röhrchen mit Stickstoffgas, verschließen Sie es und lagern Sie es wieder bei 4 °C.
2. Mykolsäure-Extraktion durch saure Methanolyse (Abbildung 2A)
- Geben Sie 2-5 ml Veresterungslösung in ein hermetisches Glasröhrchen mit einem PTFE-Liner-Schraubverschluss. 0,2 g Mykobakterienbiomasse in das Glasröhrchen geben.
Anmerkung: Die Veresterungslösung wird durch Mischen von 30 mL Methanol, 15 mL Toluol und 1 ml Schwefelsäure gebildet. Mykobakterienzellen können aus festen Kulturen oder sogar aus entlipidten Zellen entnommen werden, nachdem die Gesamtmenge der nicht-kovalenten gebundenen Lipide aus Mykobakterien extrahiert wurde (verbleibende Zellen nach der Filterung in Schritt 1.6).
Vorsicht: Toluol ist ein brennbarer und extrem gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
Vorsicht: Schwefelsäure ist ein ätzender und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
- Mischen Sie den Inhalt durch Vortexen. Lassen Sie die Mischung über Nacht in einem trockenen Bad bei 80 °C stehen.
- Lassen Sie das Röhrchen abkühlen, bis es die Raumtemperatur erreicht hat, und geben Sie dann 2 mL n-Hexan in das Röhrchen. Mischen Sie den Inhalt, indem Sie ihn 30 s lang vortexen, und lassen Sie das Rohr absetzen, bis zwei klare Phasen erscheinen.
ACHTUNG: n-Hexan ist ein potenziell brennbarer, reizender, umweltschädlicher und extrem gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
- Die obere Phase, die der n-Hexan-Phase entspricht, wird wiederhergestellt. Übertragen Sie es in eine neue Tube.
- Wiederholen Sie Schritt 2.3. Die obere Phase wird wieder entnommen und in das gleiche Röhrchen übertragen, das in Schritt 2.4 verwendet wurde.
- Verdampfen Sie den Inhalt des Rohres mit einem Stickstoffgasflussmittel. Füllen Sie das Röhrchen mit Stickstoffgas, verschließen Sie es und lagern Sie es bei 4 °C.
3. Mykolinsäure-Extraktion durch Verseifung und Methylierung (Abbildung 2B)
- 0,2 g Mykobakterien von einem festen Medium zerkratzen und in ein Glasröhrchen mit PTFE-Schraubverschluss geben.
- 2 ml Methanol-Benzol-Lösung (80:20) mit 5 % Kaliumhydroxid zugeben. Mischen Sie den Inhalt durch Vortexen. Die Mischung 3 h bei 100 °C erhitzen.
Vorsicht: Benzol ist ein brennbarer, krebserregender und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
- Lassen Sie das Rohr auf Raumtemperatur abkühlen. Fügen Sie 20 % Schwefelsäure hinzu, um die Proben anzusäuern, um einen pH-Wert = 1 zu erreichen.
- Fügen Sie 3 mL Diethylether hinzu. Mischen Sie den Inhalt vorsichtig durch Vortexen.
- Lassen Sie die beiden Phasen sich bilden, indem Sie sich absetzen. Die Diethyletherphase wird zurückgewonnen und in ein neues Röhrchen umgefüllt. Wiederholen Sie den Waschschritt insgesamt dreimal.
- Waschen Sie den Diethylether-Extrakt mit 2 mL destilliertem Wasser und geben Sie den oberen Teil, der dem Diethylether entspricht, in ein neues Röhrchen. Wiederholen Sie den Waschschritt insgesamt dreimal.
- Zum Trocknen 2 g wasserfreies Natriumsulfat über den Diethylether-Extrakt geben.
- Filtern Sie die Suspension. Verdampfen Sie den Inhalt mit einem Stickstoffgasflussmittel.
- Um den Methylierungsschritt durchzuführen, werden 3 g N-Nitroso-N-methylharnstoff in einer vorgekühlten Lösung, die aus 45 ml Diethylether und 9 ml 40 % KOH besteht, in destilliertem Wasser gelöst.
Vorsicht: N-Nitroso-N-methylharnstoff ist ein giftiger, reizender, krebserregender und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
- Den Überstand (Diazomethan) in einen neuen, in Eis abgekühlten Kolben überführen, der Kaliumhydroxid-Pellets (etwa 30 g) enthält.
Anmerkung: Wenn der Überstand nicht sofort verwendet wird, kann er bei -20 °C für maximal 1 h.
gelagert werden.
Vorsicht: Kaliumhydroxid-Pellets sind eine reizende und ätzende Substanz. Dieses Material muss in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
Vorsicht: Diazomethan ist hochgiftig und potenziell explosiv. Es muss in einer Laminar-Flow-Haube mit Sicherheitsglas verwendet werden, wobei eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) zu tragen ist.
- 2 ml der in Schritt 3.10 erhaltenen Etherlösung, die Diazomethan enthält, werden in den in Schritt 3.8 gewonnenen getrockneten Diethylether-Extrakt gegeben, der Mykolsäuren enthält. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Die Suspension wird bei 40 °C verdampft. Das Röhrchen wird mit Stickstoffgas gefüllt, verschlossen und die methylierten Lipide bei 4 °C gelagert
Anmerkung: Verdampfen Sie das Diazomethan aus der Etherlösung unter der Laminar-Flow-Haube, bis der Äther seine gelbe Farbe verliert.
4. Analyse der Dünnschichtchromatographie (DC)
- Sättigen Sie die DC-Kammer aus Glas. Decken Sie dazu eine der Wände der DC-Kammer mit einem Stück Filterpapier ab und lassen Sie es mit der mobilen Phase in Kontakt kommen, die aus der Mischung der Lösungsmittel besteht. Geben Sie das restliche Volumen des Lösungsmittels auf den Boden der DC-Kammer.
Anmerkung: Der Boden der DC-Kammer muss von mindestens 1 cm der mobilen Phase bedeckt sein. In den vorliegenden Experimenten wurden verschiedene mobile Phasen verwendet, um die TLCs zu entwickeln. Sie bestanden aus 85 mL n-Hexan plus 15 mL Diethylether; 100 ml Dichlormethan; 90 ml Chloroform, 10 ml Methanol und 1 ml Wasser; 30 ml Chloroform, plus 8 ml Methanol und 1 ml Wasser; 60 ml Chloroform plus 35 ml Methanol und 8 ml Wasser; 95 mL Chloroform plus 5 mL Methanol; und 90 mL Petrolether (60-80 °C) plus 10 mL Diethylether.
Anmerkung: Verwenden Sie in der zweidimensionalen TLC dreimal n-Hexan:Aceton (95:5) in der ersten Richtung und verwenden Sie eine einzelne Entwicklung mit Toluol:Aceton (97:3) in der zweiten Richtung, um die Mykolsäurezusammensetzung zu analysieren. Um PIMs zu analysieren, verwenden Sie einmal chloroform:methanol:wasser (60:30:6) in der ersten Richtung und verwenden Sie chloroform:essigsäure:methanol:wasser (40:25:3:6) in der zweiten Richtung. Um PDIM und AG zu analysieren, verwenden Sie dreimal Petrolether (60-80 °C):Ethylacetat (98:2) in der ersten Richtung und verwenden Sie eine einzelne Entwicklung mit Petrolether (60-80 °C):Aceton (98:2) in der zweiten Richtung.
Vorsicht: Diethylether ist ein potenziell giftiger und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
Vorsicht: Dichlormethan ist ein potenziell giftiger und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
Vorsicht: Petrolether ist ein potenziell brennbarer, umweltschädlicher und extrem gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
Vorsicht: Essigsäure ist eine potenziell brennbare und korrosive Substanz. Es muss in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
Vorsicht: Ethylacetat ist ein brennbarer und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
Vorsicht: Aceton ist ein brennbarer und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
- Schließen Sie die DC-Kammer, um sie mindestens 20 Minuten lang zu sättigen. In der Zwischenzeit lösen Sie die im Glasröhrchen vorhandenen Lipide in 0,2-1 ml Chloroform.
Anmerkung: Das Volumen, das zum Auflösen der Lipide verwendet wird, kann je nach gewünschter oder erwarteter Konzentration der Probe modifiziert werden.
- Geben Sie 10 μl jeder Suspension mit einem Kapillarglasröhrchen direkt auf die DC-Platte und lassen Sie die Probe 5 Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen.
Anmerkung: Die Proben müssen auf den unteren Teil der Platte aufgetragen werden, wobei auf jeder Seite 1 cm verbleiben muss. Die Proben müssen mindestens 0,5 cm voneinander entfernt sein. Sobald die Probe auf die Platte aufgetragen wurde, können die Röhrchen wieder mit Stickstoffgas verdampft und bei 4 °C für die weitere Verwendung gelagert werden.
- Setzen Sie die Platte in die gesättigte DC-Kammer ein, in der sich die mobile Phase befindet. Lassen Sie die mobile Phase über die TLC laufen.
Anmerkung: Jede Bewegung, die auf die DC-Kammer ausgeübt wird, wirkt sich auf das laufende Lösungsmittel auf der Platte aus und beeinflusst die Beweglichkeit der Lipide. Bei der Durchführung einer zweidimensionalen DC-Behandlung sind zwei DC-Kammern erforderlich, die beide Elutionssysteme enthalten.
- Nehmen Sie die Platte aus der DC-Kammer, wenn das Lösungsmittel einen Abstand von 1 cm vom oberen Ende der Platte erreicht. Lassen Sie die Platte unter laminarem Flussmittel, bis die Kieselsäure vollständig getrocknet ist.
Anmerkung: Im Falle der Analyse der Mykolsäurezusammensetzung mit n-Hexan und Diethylether (85:15) wiederholen Sie die Schritte 4.4 und 4.5 noch zweimal, bis Sie die mobile Phase dreimal über die DC-Platte laufen lassen.
- Legen Sie die Platte mit dem gewünschten Fleck frei und erhitzen Sie die Platte bei Bedarf.
Anmerkung: Im vorliegenden Versuch wurden 15-20 ml der folgenden Lösungen verwendet, um die DC-Platten zu besprühen: 10 % Molybdatophosphorsäurehydrat in Ethanol, bis die Platte hellgelb ist, gefolgt von Erhitzen der Platte auf 120 °C; 5 % in Ethanol von 20 % α-Naphthol in Schwefelsäure, gefolgt von Erhitzen der Platte auf 120 °C; Molybdänblau-Reagenz (1,3 % Molybdänoxid in 4,2 M Schwefelsäure) bis zum Auftreten von Phosphatbanden oder 1 % Anthron in Schwefelsäure.
Vorsicht: Molybdatophosphorsäurehydrat ist eine brennbare und ätzende Substanz. Es muss in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
Vorsicht: Ethanol ist ein potenziell brennbarer und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
ACHTUNG: 1-Naphthol ist ein brennbarer, ätzender und extrem gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
Vorsicht: Molybdänblau-Sprühreagenz ist eine ätzende, giftige und extrem gefährliche Substanz. Es muss in einer Laminar-Flow-Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
