Heparin-Affinitätschromatographie-basierte Baculovirus-Aufreinigung: Eine Technik zur Isolierung von Baculoviren aus Insektenzellüberständen

Zusammenfassung

Quelle: Nasimuzzaman, M. et al., Produktion und Reinigung von Baculoviren für die Anwendung in der Gentherapie. J. Vis. Exp. (2018)

In diesem Video demonstrieren wir die Technik zur Isolierung von Baculoviren aus einem Insektenzellüberstand mittels Heparin-Affinitätschromatographie. Die Isolierung wird durch die Affinität zwischen dem Heparin in der Säule und dem Baculovirus-Hüllglykoprotein erleichtert.

Protokoll

1. Vorbereitung des Chromatographiesystems

1. Bereiten Sie das Chromatographiesystem vor, indem Sie die Proben- und Pufferleitungen nacheinander mit sterilem Wasser, 1 N Natriumhydroxid, Wasser und Waschpuffer (20 mM Natriumphosphatpuffer mit 150 mM Natriumchlorid, pH 7,0) bei einer linearen Flussrate von 50 mL/min spülen.
2. Bereiten Sie eine 50-μm-Heparinsäule (10 × 10 cm, 7,9 mL Säulenvolumen (CV)) vor, indem Sie nacheinander einen Säulenreinigungspuffer (5 CV steriler 20 mM Natriumphosphatpuffer mit 2 M Natriumchlorid, pH 7,0) und einen 5 CV-Waschpuffer bei einer linearen Flussrate von 7 mL/min laufen lassen.

2. Aufreinigung des Baculovirus-Vektors

1. Richten Sie das Chromatographiesystem wie folgt ein:
   1. Verwenden Sie die Einlassöffnung für die Probenbeladung zum Laden des Baculovirus-Überstands.
   2. Verwenden Sie den Puffereinlassanschluss A1 zum Beladen des Waschpuffers. Bereiten Sie eine Flasche mit mindestens 500 ml Waschpuffer vor und legen Sie die Waschpufferleitung in die Flasche.
   3. Verwenden Sie den Puffereinlassanschluss A2 zum Laden des Elutionspuffers (20 mM Natriumphosphat mit 1,5 M Natriumchlorid, pH 8,0). Bereiten Sie eine Flasche mit mindestens 500 mL Elutionspuffer vor und geben Sie die Elutionspufferleitung in die Flasche.
   4. Führen Sie mehrere konische 50-ml-Röhrchen in den Fraktionssammler ein, um den Säulendurchgangs-Baculovirus-Überstand, den Waschpuffer und das eluierte Baculovirus zu sammeln.
2. Äquilibrieren Sie die Heparinsäule mit fünf 7,9 mL Säulenvolumina (CVs) Waschpuffer (40 mL) bei einer linearen Flussrate von 7,0 mL/min.
3. Laden Sie 250 mL des Baculovirus-Überstands mit der Probenpumpe (Einlass-Probenöffnung) des Chromatographiesystems mit einer linearen Flussrate von 2,0 mL/min auf die Heparinsäule.
4. Lassen Sie 10 CVs (80 mL) Waschpuffer mit einer linearen Flussrate von 2,0 mL/min durch die Heparinsäule laufen, bis die Absorptionskurve für ultraviolettes (UV) Infraviolett (UV) (280 nm) wieder auf den Ausgangswert zurückgekehrt und stabil wird.
5. Eluieren Sie die Baculovirus-Partikel aus der 7,9-ml-Heparinsäule mit 5 CVs (40 mL) Elutionspuffer bei einer linearen Flussrate von 4,0 mL/min. Achten Sie auf einen scharfen Elutionspeak des Proteins auf dem Chromatogramm, wenn die Baculovirus-Partikel von der Heparinsäule dissoziieren.
6. Nach der Elution ist der eluierte Baculovirus-Überstand sofort 10-fach mit 20 mM Natriumphosphatpuffer in Wasser zu verdünnen, um eine Inaktivierung von Baculovirus-Partikeln durch osmotischen Schock während der nachfolgenden Zentrifugation zu verhindern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Akta Avant 150	GE Gesundheitswesen	28976337	Chromatographie-System
POROS Heparin 50 μm Säule	ThermoFisher Scientific	4333414	Heparin-Säule
Puffer waschen	betriebseigen	Nicht-Katalogartikel	20 mmol/l Phosphatpuffer mit 150 mmol/l Natriumchlorid
Elutions-Puffer	betriebseigen	Nicht-Katalogartikel	20 mmol/l Phosphatpuffer mit 1,5 mol/l Natriumchlorid
50 ml konisches Röhrchen	ThermoFisher Scientific	14-959-49A	Zur Entnahme von Baculovirus-Überständen
Puffer für die Reinigung der Säule	betriebseigen	Nicht-Katalogartikel	20 mmol/l Phosphatpuffer mit 2,0 mol/l Natriumchlorid
Steriles Wasser	betriebseigen	Nicht-Katalogartikel	Für die Reinigung von Akta Avant
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	1,09137	Für die Reinigung von Akta Avant