Kationenaustauschchromatographie: Eine Technik zur Isolierung von rekombinantem Zielprotein aus Insektenzelllysat basierend auf der Nettooberflächenladung

Zusammenfassung

Quelle: Agamasu, C. et al. Vollständig verarbeitetes rekombinantes KRAS4b: Isolierung und Charakterisierung des farnesylierten und methylierten Proteins. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video demonstriert die Kationenaustauschchromatographie-Technik zur Isolierung von rekombinantem Protein aus dem Insektenzellproteinlysat.

Protokoll

1. Protein-Aufreinigung

1. Bereiten Sie die Puffer A–H vor, wie in Tabelle 1 dargestellt.

kg kg kg kg kg kg kg kg

Pufferlösung	Puffermittel (alle 20 mM)	Ph	NaCl (mM)	Imidazol (mM)	MgCl2	TCEP
ein	HEPES	7,3	300	-	5	1
Vgl.	HEPES	7,3	300	35	5	1
C	HEPES	7,3	300	500	5	1
D	Mes	6,0	200	-	5	1
E	Mes	6,0	-	-	5	1
F	Mes	6,0	100	-	5	1
G	Mes	6,0	1000	-	5	1
H	HEPES	7,3	300	-	1	1

2. Bereiten Sie die Aufreinigungsmaterialien vor (siehe Materialtabelle): Proteaseinhibitor-Cocktail ohne EDTA oder andere Chelatoren; immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie-Säule (IMAC); Kationenaustauschchromatographie-Säule (CEX); 0,45-μm-Spritzenvorsatzfilter; 2 M Imidazol (pH = 7,5); Ultrazentrifuge mit einer Kapazität von 100.000 x g; Hochgeschwindigkeits-Tischzentrifuge mit einer Kapazität von 4.000 x g; Zentrifugalfilteranlagen (10 KDa NMWL); Spektralphotometer zum Ablesen bei 280 nm; Protease des His6-Tabak-Ätzvirus (TEV); und Chromatographie-Instrumente, die in der Lage sind, zwei Pufferlösungen zu mischen, Lösungen auf Säulen aufzutragen, Gradientenelutionen aus der Säule zu erzeugen und Fraktionen aus Säulen zu sammeln.
3. Entfernen Sie das Insektenzelllysat aus der Dialyse und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 4.000 x g, um eventuellen Niederschlag zu entfernen. Die endgültige, dialysierte, geklärte Probe ist zu diesem Zeitpunkt noch oft trüb, kann aber ohne weitere Verarbeitung auf die nachfolgende CEX-Säule aufgetragen werden.
4. Eine 20-ml-Kationenaustauschsäule (siehe Materialtabelle) wird durch Waschen mit drei CVs Puffer G und dann mit drei CVs mit Puffer F.
   Anmerkung: Während wir andere Harze nicht sorgfältig evaluiert haben, haben mehrere Kollegen bei anderen Harzen als SP Sepharose High Performance eine schlechte Auflösung festgestellt.
5. Verdünnen Sie 20 mL der dialysierten Probe auf eine NaCl-Endkonzentration von 100 mM durch Zugabe von 20 mL Puffer E und tragen Sie die verdünnte Probe auf die Kationenaustauschersäule auf.
6. Fahren Sie mit der Beladung der Säule fort, indem Sie frisch verdünnte Proben, die wie oben beschrieben vorbereitet wurden, in das Laderöhrchen geben, da sich die vorherige Verdünnung dem Ende der Beladung nähert.
   Anmerkung: Die Verdünnung der gesamten Probe auf einmal auf 100 mM NaCl hat zu einem erheblichen Verlust des Zielproteins durch Fällung geführt.
7. Waschen Sie die Säule mit Puffer F auf den Ausgangswert Abs280. Dies erfordert in der Regel 3 CV. Das Protein wird während eines 400 ml (20 CV) Gradienten von Puffer F zu 65 % Puffer G aus der Säule eluiert und in 6 ml-Fraktionen gesammelt (Abbildung 1B).
8. Waschen Sie die Säule für weitere 1,5 CV (65 % Puffer G), sobald der Gradient abgeschlossen ist.

Ergebnisse

Abbildung 1: SDS-PAGE-Gele des Aufreinigungsprozesses. (A) IMAC-Abscheidung aus Lysat. FNTA/B sind die dunklen Banden, die bei ~48 kDa migrieren, und His6-MBP-tev-KRAS4b ist die dunkle Bande, die bei ~67 kDa migriert. M = Protein-Molekulargewichtsleiter; T = Gesamtprotein; L = geklärtes Lysat/Säulenlast; F = Spaltendurchfluss. Die Fraktionen werden mit einem zunehmenden Imidazol-Konzentrationsgradie...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,8 mL Safe-Lock Röhrchen, natur	Eppendorf	22363204
11 mm Cl SS Autosampler-Fläschchen mit verriegeltem Einsatz	Thermo Scientific	Artikel-Nr.: 30211SS-1232
5427R Zentrifuge	Eppendor
Acetonitril, HPLC-Qualität	Fisher Chemical	A998-1 1L
Säule für Kationenaustauschchromatographie (CEX)	GE Healthcare Life Sciences	29018183	HiPrep SP Sepharose Hohe Leistung
Exactive Plus EMR-Massenspektrometer	Thermo Scientific
Gilson Fläschchen 7x14 mm Röhrchen	GE Gesundheitswesen	BR-1002-12
Hochgeschwindigkeits-/Tischzentrifuge	Thermo Fischer Scientific	05-112-114D	Geeignet für bis zu 4.000 xg
His6-Tabak-Ätzvirus (TEV)-Protease	Addgene	Artikel-Nr.: 92414	Aufgereinigt nach Raran-Kurussi et al. (2017) Entfernung von Affinitäts-Tags mit TEV-Protease. In: Burgess Brown N. (Hrsg.) Heterologe Genexpression in E.coli. Methoden in der Molekularbiologie, Bd. 1586. Humana Press, New York, Vereinigte Staaten von Amerika
Proteasehemmer Cocktail ohne EDTA oder andere Chelatoren	Millipore Sigma	Nr. P8849
Ammoniumacetat	Sigma-Aldrich	09689-250g
Argongas	Airgas	ARUP
Ameisensäure	Sigma-Aldrich	F0507-500MI	Verwenden Sie Reagenzienqualität oder besser
NGC-Chromatographie-System	BioRad	78880002	NGC QuestTM 100 Chromatographie-System
Lipid Extruder Set mit Halterung	AVANTI POLARE LIPIDE	610023
Flüssigstickstoff	Airgas	NI-DEWAR
Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheiten, 10K NMWL	Millipore Sigma	UFC901008	PES-Membran
Ultracel 10K MWCO Ultra 0,5 mL Zentrifugenfilter	Amicon	UFC501024
Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	Optima - L80K	Fähig für 100.000 xG
chaps	Sigma	Nr. C3023