1. Herstellen und Charakterisieren des Antikörpers
- Exprimieren Sie den Antikörper
- Ein Fläschchen mit HEK-Suspensionszellen wird in einem 250-ml-Kolben aufgetaut, der 50 ml Expressionsmedium enthält, das mit 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 250 ng/ml Amphotericin B ergänzt wird. Die Zellen werden in befeuchteten Inkubatoren mit einem Schüttler bei 125 U/min bei 37 °C und 8 % CO2 aufbewahrt. Teilen Sie die Zellen mindestens 2 Mal vor der Transfizierung auf 0,3-0,5 x 106 Zellen/ml (alle 2-3 Tage).
- Wenn eine Dichte von 2,5 x 106 Zellen/ml erreicht ist (2-3 Tage nach der Teilung), bereiten Sie eine frische Lösung von 100 mM CypK vor. Wiegen Sie zu diesem Zweck 64 mg CypK, fügen Sie 2,5 ml 0,1 Natriumhydroxid hinzu, wirbeln Sie nach unten, um alle ungelösten Partikel zurückzugewinnen, und beschallen Sie.
- 2,5 ml CypK (100 mM in 0,1 M NaOH) zu 42,5 ml Expressionsmedium hinzufügen, das mit Antibiotika ergänzt wird. Gut mischen, 250 μl 0,1 M HCl zugeben und mit einem 0,22 μm Filter sterilisieren.
- Verdünnen Sie 50 μg HC- und LC-pKym1-Plasmide auf 2,5 mL mit reduziertem Serummedium. In einem separaten Röhrchen 135 μl Transfektionsreagenz auf 2,5 ml mit reduziertem Serummedium verdünnen.
- Fünf Minuten nach der Herstellung der Lösungen werden die Plasmide und die Transfektionsreagenzlösung gemischt und 20 Minuten lang inkubiert, um die Bildung von Komplexen zwischen der DNA und dem Transfektionsreagenz zu ermöglichen.
- In der Zwischenzeit werden 125 Millionen Zellen bei der Zieldichte 5 min lang bei 500 x g zentrifugiert, mit dem CypK-haltigen Expressionsmedium resuspendiert und das DNA-Transfektions-Reagenzgemisch zugegeben. CypK kann, wie bereits berichtet, gekauft oder synthetisiert werden.
- Nach 20-stündiger Inkubation der Zellen fügen Sie 250 μl Transfektionsreagenzienverstärker hinzu, die im Kit enthalten sind.
- Ernten Sie Antikörper aus dem Überstand 6-7 Tage nach Zugabe von CypK (während der Expression ist kein Wechsel des Mediums erforderlich).
*Um höhere und konsistentere Erträge zu erzielen, kann alternativ eine stabile Zelllinie erzeugt werden, wie in Oller-Salvia et al. 2018 beschrieben. In diesem Fall wird Trastuzumab(CypK)2 einfach durch Zugabe von CypK 5 mM in das Expressionsmedium exprimiert.
- Aufreinigung des Antikörpers
- Die Zellen 15 min bei 3000 x g zentrifugieren.
- Den Überstand mit einem 0,45 oder 0,22 μm Filter filtrieren. Wenn der Filter verstopft ist, ersetzen Sie ihn durch einen neuen und fahren Sie mit dem Filtern fort. Geschieht dies bereits nach wenigen Millilitern, zentrifugieren Sie den Überstand für weitere 15 min bei 7000 x g.
- Geben Sie Protein-A-Harz (2 ml/100 mL Überstand) in eine leere Polypropylen-Chromatographiesäule und äquilibrieren Sie das Harz mit mindestens 5 Volumina Bead Wash Puffer (0,1 M Natriumphosphat, 150 mM NaCl).
- Teilen Sie den Überstand in zwei konische 50-ml-Röhrchen auf und fügen Sie 5x Bead-Wash-Puffer (0,5 M Natriumphosphat, 150 mM NaCl) hinzu, gefolgt von dem voräquilibrierten Protein-A-Harz. Das konische Röhrchen wird 3 h lang bei Raumtemperatur auf eine Rolle gestellt, um den Antikörper im Überstand nach unten zu ziehen.
- Alternativ: Den Überstand mit mindestens dem doppelten empfohlenen Harzvolumen auf die Säule geben und durchfließen lassen. Stellen Sie sicher, dass sich keine signifikante Menge an Antikörpern im Überstand von SDS-PAGE befindet. Wenn ja, eluieren Sie den Überstand erneut durch das Harz.
- Übertragen Sie das Protein-A-Harz mit dem Überstand in eine Säule und lassen Sie die Flüssigkeit durchströmen.
- Fügen Sie 25 mL Waschpuffer (oder mindestens 10 Harzvolumen) hinzu und lassen Sie es durchfließen.
- Eluieren Sie den Antikörper mit 4 mL 0,1 M Natriumcitrat, pH 3, auf 1 mL 1 M Phosphatpuffer, 150 mM NaCl.
- Verdünnen Sie den Antikörper mit 10 mL PBS, konzentrieren Sie ihn durch Zentrifugalfiltration auf 0,5-1 mL und tauschen Sie den Puffer dreimal mit PBS aus.
- Aufreinigung der Proben mittels FPLC unter Verwendung einer Butyl-HIC-Säule mit einem Durchfluss von 0,5 ml/min und einem Gradienten von 0-100 % in 30 min aus salzarmem Puffer (50 mM Natriumphosphat pH 7,0, 20 % Isopropanol) in Puffer mit hohem Salzgehalt (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM Natriumphosphat pH 7,0, 5 % Isopropanol). Sammeln Sie alle Fraktionen und überwachen Sie die Elution bei 280 nm. Kleine Mengen (< 1 mg) können mit HPLC-HIC unter den in 2.4 beschriebenen Bedingungen gereinigt werden, um die Ausbeute und Reinheit zu maximieren.
- Die antikörperhaltigen Fraktionen werden gepoolt, mit PBS auf mindestens 4 mL verdünnt, durch Zentrifugalfiltration konzentriert und der Puffer dreimal mit PBS ausgetauscht.
- Quantifizierung des Antikörpers
- Erhalten Sie eine ungefähre Konzentration, indem Sie die Extinktion bei 280 nm mit einem Mikrovolumen-Spektralphotometer messen.
- Wenn eine genaue Messung erforderlich ist, verwenden Sie ein ELISA-Kit, um menschliche IgGs zu messen. Für eine grobe Abschätzung verwenden Sie SDS-PAGE mit einem Fleck auf Coomassie-Basis wie folgt:
- Bei der Herstellung von Standards wird ein durch ELISA quantifizierter Trastuzumab-Standard sechsmal doppelt so hoch wie folgt auf 1 mg/ml verdünnt.
- Kochen Sie die Standards und die Proben bei ca. 0,25 mg/ml in einem reduzierenden Beladungspuffer.
- Lassen Sie sie in einer 4-12%igen Bis-Tris SDS-PAGE mit MES-SDS-Puffer laufen und färben Sie sie mit einem Farbstoff auf Coomassie-Basis. Messen Sie abschließend die Farbdichte des Bandes, das der leichten oder der schweren Kette entspricht, mit ImageJ und interpolieren Sie das Signal aus den Samples in der Standardkurve.
- Lagern Sie den Antikörper bei 4 °C.
2. Konjugieren des Antikörpers und Charakterisieren des ADC
- Konjugieren Sie den Antikörper mit dem tetrazinhaltigen Molekül
- Verdünnen Sie 10 molare Äquivalente von Tetrazin-vcMMAE (4 μl, 3,4 mM in Dimethylsulfoxid (DMSO)) mit 20 μl Acetonitril und 76 μl PBS in einem kleinen konischen Röhrchen (z. B. PCR-Röhrchen).
- 1 molares Äquivalent Trastuzumab(CypK)2 (100 μL, 2 mg/ml in PBS) zugeben, gründlich mischen und 3 h bei Raumtemperatur (25 °C) zu Trastuzumab(MMAE)2,
Anmerkung: Andere Moleküle wie Tetrazin-5-TAMRA können mit diesem Protokoll anstelle von Tetrazin-vcMMAE an den Antikörper gebunden werden.
- Reinigen Sie den ADC
- Führen Sie eine Größenausschluss-Spin-Säule mit PBS gemäß den Anweisungen des Herstellers voräquilibrieren.
- Das gesamte Volumen der Reaktion auf die Spin-Säule geben und bei 1500 x g 1 min zentrifugieren.
- Quantifizierung des ADC und Analyse des Konjugats mittels SDS-PAGE
- Quantifizieren Sie den ADC wie in 1.3.2. beschrieben, indem Sie die Farbdichte der Leichtkette auf einer SDS-PAGE unter Verwendung des unmodifizierten Antikörpers für die Standardkurve messen.
- Die schwere Kette sollte sich leicht verschoben haben, was eine Zunahme des Molekulargewichts bei der Konjugation zeigt.
Hinweis: Wenn der Antikörper mit einem Fluorophor wie in Trastuzumab(TAMRA)2 modifiziert wird, sollte vor der Färbung nur die Bande, die der Schwerkette entspricht, eine In-Gel-Fluoreszenz aufweisen.
- Analyse des Konjugats mittels HPLC-HIC
- Die HPLC-HIC-Säule wird 5 min lang mit 100 % Puffer A (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM Natriumphosphat pH 7,0, 5 % Isopropanol) äquilibriert.
- Mischen Sie 15 μl (67 pmol) einer 1 mg/ml-Lösung von Trastuzumab(CypK)2 mit 15 μl 2x Puffer A in einer Durchstechflasche. Programmieren Sie dann eine 10 μL Injektion in die HPLC.
- Eluieren Sie in einem isokratischen Fluss von 1 mL/min mit 100 % Puffer A für 1 min, gefolgt von einem 15 minütigen Gradienten von 100 auf 0 % von Puffer A in B (50 mM Natriumphosphat pH 7,0, 20 % Isopropanol). Überwachen Sie die Elution bei 280 nm.
- Berechnen Sie den DAR, indem Sie den Peak, der jeder Art entspricht, integrieren und die resultierenden Flächen in der folgenden Gleichung verwenden:
DAR = (1x Trastuzumab(MMAE) + 2x Trastuzumab(MMAE)2)
/(Trastuzumab(MMAE)0 + Trastuzumab(MMAE)1 + Trastuzumab(MMAE)2)
Die erwartete Retentionszeit für Trastuzumab(CypK)2 beträgt 7,5-8,0 min, für Trastuzumab(CypK, MMAE) 9,1-9,6 min und für Trastuzumab(MMAE)2 10,5-11,0 min.