DFE-basierte Affinitätschromatographie: Eine Technik zur Aufreinigung von monoklonalen 2F5-Antikörpern aus einer Rohprobe unter Verwendung von Elutionsbedingungen mit hoher Ionenstärke

Abstract

Quelle: Knödler, M. et al., Aktivierte vernetzte Agarose für die schnelle Entwicklung von Affinitätschromatographie-Harzen - Antikörpereinfang als Fallstudie. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video beschreibt eine Affinitätschromatographie-Technik zur Aufreinigung von monoklonalen 2F5-Antikörpern unter Verwendung der DsRed-2F5-Epitop- oder DFE-Liganden. Die gereinigten monoklonalen 2F5-Antikörper sind unentbehrliche Medikamente in der Immuntherapie.

Protocol

1. Testen der Reinigung von mAbs aus geklärten Pflanzenextrakten

1. Bereiten Sie 100 ml geklärten Pflanzenextrakt vor, der 2F55 oder den Überstand aus dem bevorzugten zellbasierten Expressionssystem enthält, der ebenfalls 2F5 enthält.
2. Herstellung von Äquilibrierungspuffer (20 mM Natriumphosphat, 500 mM Natriumchlorid, pH 7,4), Elutionspuffer mit niedrigem pH-Wert (0,05 M Citrat, 0,05 M Natriumchlorid, pH 4,0–3,25) und Elutionspuffer mit hoher Ionenstärke (1,0–4,0 M Magnesiumchlorid, 0,1 M HEPES, pH 8,0)
3. Spülen Sie das Chromatographiesystem mit den Puffern. Montieren Sie eine DFE-Affinitätssäule (siehe Hauptprotokolltext) an das Chromatographiesystem und äquilibrieren Sie mit 5 CV Äquilibrierungspuffer bei einer Flussrate von 1,0 mL ^min-1. Überwachen Sie die UV-Absorption bei 280 nm.
   Anmerkung: Das Laden von Pflanzenextrakt oder Zellkulturüberstand auf die Säule kann zu einem Anstieg des Gegendrucks führen. Stellen Sie einen Hochdruckalarm auf 0,2 MPa ein, um Schäden am Chromatographiesystem oder der DFE-Säule zu vermeiden.
4. Laden Sie 80 mL des geklärten Pflanzenextrakts oder Überstands (Schritt 1.1) mit einer Flussrate von 0,5 mL min-1 auf die Säule, um eine Kontaktzeit von 2 min zu gewährleisten. Sammeln Sie die Durchflussproben in 2-ml-Fraktionen für die Rekonstruktion der Durchbruchskurve. Lagern Sie die Durchflussproben bei 4 °C, wenn eine sofortige Probenanalyse nicht möglich ist.
5. Waschen Sie die Säule mit 6 CV Äquilibrierungspuffer. Entnehmen Sie eine Probe der Wäsche zu Beginn, in der Mitte und am Ende dieses Schritts.
6. Eluieren Sie mAb 2F5 mit 5 CV Elutionspuffer mit niedrigem pH-Wert oder Elutionspuffer mit hoher Ionenstärke (0,1 M HEPES, 1,25 M Magnesiumchlorid, pH 8,0). Erfassen Sie die DFE-Fraktion, wenn das UV-Signal von 280 nm auf 5 mAU über der Basislinie angestiegen ist.
   1. Optimieren Sie den Elutionspuffer für jedes Epitop-Antikörper-Paar. Für 2F5 erreichte 1,25 M Magnesiumchlorid ein optimales Gleichgewicht zwischen Produktrückgewinnung und Ligandenstabilität.
      Anmerkung: Die Magnesiumchloridlösung neigt zu Ausfällungen. Lösen Sie daher das Magnesiumchlorid in ~700 mL Wasser auf. Lösen Sie die HEPES separat in 100 mL Wasser auf und stellen Sie den pH-Wert auf 8,0 ein. Geben Sie die gelöste Magnesiumchloridlösung zur HEPES-Lösung und fügen Sie Wasser bis zu einem Endvolumen von 1,0 l hinzu. Stellen Sie den pH-Wert nach dem Auflösen des Magnesiumchlorids nicht ein, da dies zu Ausfällungen führt.
7. Analysieren Sie alle Proben, die in den Schritten 1.4 bis 1.6 entnommen wurden, mit der Bradford-Methode, der Lithiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (LDSPAGE) und der Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DsRot	Fraunhöfe IME	n/a	Standart
HiTrap NHS-aktivierte Sepharose HP, 1 mL	GE Helthcare	Artikel-Nr.: 17-0716-01	Chromatographie-Säulen
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Puffer-Komponente
Magnesiumchlorid	Carl Roth GmbH	KK36.2	Puffer-Komponente
PH 3110	WTW	2AA110	pH-Messgerät
Sephadex G-25 feines, vernetztes Dextran	GE Helthcare	17003301	Chromatographie-Harz
Natriumchlorid	Carl Roth GmbH	Nr. P029.2	Puffer-Komponente
Natriumcitrat	Carl Roth GmbH	HN13.2	Puffer-Komponente