Dünnschichtchromatographie-basierter Enzymaktivitätsassay: Eine Technik zur Bestimmung der In-vitro-Pyrophosphokinase-Aktivität mittels Dünnschichtchromatographie

Zusammenfassung

Quelle: Pokhrel, A., et al. Ein Aufreinigungs- und In-vitro-Aktivitätsassay für eine (p)ppGpp-Synthetase aus Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt einen auf Dünnschichtchromatographie basierenden Enzymassay zur Bestimmung der Pyrophosphokinase-Aktivität mit radioaktiv markierten Nukleotiden. Die Methode gibt Einblicke in die Nukleotidsynthese und Phosphotransferreaktionen.

Protokoll

1. Proteinaktivitätsassay mittels Dünnschichtchromatographie

1. Bereiten Sie die Dünnschichtchromatographie (DC)-Platte vor.
   1. Bereiten Sie Polyethylenimin (PEI)-Zelluloseplatten vor, indem Sie sie in entionisiertem Wasser waschen. Legen Sie die Platten in eine Glaskammer mit doppelt destilliertem Wasser bis zu einer Tiefe von ~0,5 cm.
   2. Lassen Sie das Wasser an die Oberseite der Platte wandern.
      HINWEIS: Das Waschen der Platten ist nicht unbedingt erforderlich, da die Platten auch ohne Waschen verwendet werden können, aber das Waschen erhöht die Klarheit der resultierenden Bilder. Durch das Waschen der Platten in zwei senkrechten Richtungen wird außerdem sichergestellt, dass alle im Harz vorhandenen Verunreinigungen in einer Ecke der Platte isoliert werden (Abbildung 1).
   3. Nehmen Sie die Platten aus der Glaskammer und lassen Sie sie über Nacht (12–18 h) auf einem Gestell trocknen.
   4. Markieren Sie die trockenen Platten mit einem weichen Bleistift 2,0 cm von einer Kante entfernt, um anzugeben, wo die Proben für die TLC aufgetragen werden. Für 2 μl Proben sind Proben in einem Abstand von mindestens 1,0 cm aufzubringen (Abbildung 1).
      HINWEIS: Dies ermöglicht eine klare Trennung zwischen benachbarten Punkten, was für die Signalquantifizierung entscheidend ist. Solange das Zelluloseharz nicht zerkratzt wird, beeinträchtigen kleine Bleistiftmarkierungen auf der Oberfläche die Lösungsmittelmigration nicht.
   5. Lassen Sie bei der Planung von Versuchen immer einen Fleck auf jeder Platte ungenutzt.
      HINWEIS: Dadurch wird eine leere Spur für die Probenquantifizierung bereitgestellt (Abbildung 1). Eine 20 cm lange TLC-Platte bietet Platz für 19 Plätze.
2. Enzymaktivitäts-Assay
   1. Bereiten Sie eine 5-fach-Puffermischung vor, die 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM Ammoniumacetat, 10 mM KCl, 1 mM DTT und 0,6 mM ATP (Adenosintriphosphat) enthält.
      HINWEIS: Diese Mischung kann in großen Mengen zubereitet und in 10 μl Aliquoten für die spätere Verwendung eingefroren werden. Setzen Sie das Mischgut nicht mehreren Gefrier-Tau-Zyklen aus.
   2. Bereiten Sie Einzelreaktionen vor, die 3 μM RSH (Rel/Spo-homologe Enzyme), 1x Puffermix, 0,6 mM GDP (Guanosindiphosphat) und 1,2 mM MgCl₂ enthalten. Fügen Sie 1,0 μCi ^γ-32P-ATP (radioaktiv markiertes ATP) pro 10 μl Reaktion hinzu und verwenden Sie nukleasefreies Wasser, um die Reaktion auf ein gewünschtes Volumen zu bringen. Fügen Sie das RSH hinzu, nachdem die anderen Komponenten gemischt wurden, da die Zugabe von RSH zu der nukleotidhaltigen Mischung den enzymatischen Aktivitätsassay einleitet.
      HINWEIS: Das endgültige Reaktionsvolumen hängt von der Anzahl der abgetasteten Zeitpunkte ab. Zur Probenahme von 2 μl/Zeitpunkt werden 10 μl Reaktionsgemisch für jeweils 4 Zeitpunkte zusammengesetzt.
   3. Um die ATP-Hydrolyse vor einer Kontamination der Nukleaseaktivität zu schützen, wird eine 10-μl-Reaktion ohne Protein zusammengebaut und parallel inkubiert. 2 μl-Proben bei t = 0 und am Ende des Versuchs prüfen, um sicherzustellen, dass ATP in Abwesenheit des Proteins nicht hydrolysiert wurde.
   4. Unmittelbar nach der Zugabe von RSH werden 2 μl entfernt und als t = 0 min Probe auf die markierte PEI-Zelluloseplatte aufgetragen.
   5. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 °C und entfernen Sie 2 μl Aliquots zu den gewünschten Zeitpunkten.
      HINWEIS: Die enzymatische Aktivität hört auf, wenn die Probe an der Zelluloseplatte adsorbiert wird. Warten Sie 10–30 Minuten, nachdem der letzte Fleck vor der Entwicklung auf die Platte gegeben wurde, um eine vollständige Adsorption und Probentrocknung sicherzustellen.
3. Dünnschicht-Chromatographie
   1. Füllen Sie die Chromatographiekammer mit 1,5 M 1,5 M KH₂PO₄ (pH 3,64) bis zu einer Tiefe von 0,5 cm.
      HINWEIS: Das benötigte Volumen hängt von den Abmessungen des Chromatographie-Tanks ab. Jeder Glasbehälter mit einem ebenen Boden, der breit genug ist, um das Einsetzen der DC-Platte ohne Biegen zu ermöglichen, kann mit einer zusätzlichen Abdeckung als Entwicklungsbecken verwendet werden. Die DC-Platte kann mit einer sauberen Rasierklinge in schmalere Streifen geschnitten werden, um die Entwicklung in einem mit Kunststofffolie überzogenen Glasbecherglas zu ermöglichen.
   2. Tauchen Sie den unteren Rand der Platte in Lösungsmittel. Lassen Sie das Lösungsmittel an die Oberseite der Platte wandern (~90 min).
      HINWEIS: Obwohl die Lösungsmittelmigration an der Oberseite der Platte stoppt und die Proben bei längerem Eintauchen nicht verloren gehen oder zusammenlaufen, sollten die Platten nicht über Nacht im Lösungsmittel belassen werden. Eintauchen von mehr als 4 h kann dazu führen, dass sich das Harz von der Plattenunterlage löst und zu Signalverlusten führt.
   3. Nehmen Sie die Platte aus dem Chromatographietank und legen Sie sie auf einen Wäscheständer.
   4. Lassen Sie die Platte über Nacht an der Luft trocknen.
      HINWEIS: Das Trocknen kann mit einem Fön beschleunigt werden. Die Trockenheit kann anhand der Farbe des Harzes beurteilt werden, das bei Nässe nachdunkelt und bei vollständiger Trocknung wieder die Farbe einer unbenutzten Platte annimmt.
   5. Nachdem die Platte getrocknet ist, wickeln Sie die Platte in eine Plastikfolie ein, um eine Übertragung von radioaktivem Material auf die Bildgebungskassette zu vermeiden, und analysieren Sie sie durch Autoradiographie (Abbildung 2).
4. Datenanalyse
   1. Die PEI-Zelluloseplatte mit den getrennten Reaktionen wird 4 h lang bei Raumtemperatur einer Phosphorimager-Kassette ausgesetzt.
      HINWEIS: Dies ist eine ausreichende Belichtung, um mit den angegebenen Konzentrationen von frischem ^γ-32P-ATP ein sehr klares Bild zu erhalten. Wenn geringere Mengen an radioaktiv markiertem Substrat verwendet werden, kann die Belichtungszeit auf 12-16 h erhöht werden.
   2. Bilden Sie die Kassette auf einem Phosphorimager ab.
   3. Zeichnen Sie mithilfe einer Imaging-Software mit einer grafischen Benutzeroberfläche Regions of Interest (ROIs), indem Sie "Rechteck zeichnen" auswählen und mit der Maus rechteckige ROIs um eine gesamte Spur und die ATP- und ppGpp-Spots (Guanosintetraphosphat) zeichnen, die in dieser Spur enthalten sind (Abbildung 2).
   4. Verwenden Sie die Befehle "Auswählen", "Kopieren" und "Einfügen" (oder entsprechende Befehle, die auf der verwendeten Bildgebungssoftware basieren), um identische ROIs innerhalb der anderen Lanes zu zeichnen, um sicherzustellen, dass die ROIs das Signal in identischen Bereichen in jeder Lane messen. Fügen Sie ROIs von einer ungenutzten Lane hinzu, die als Leerzeichen verwendet werden sollen.
   5. Über die Schaltfläche Analysieren | Werkzeuge | ROI-Manager | Fügen Sie Befehle der Bildgebungssoftware hinzu und wählen Sie alle ROIs aus, die auf der PEI-Zelluloseplatte gezeichnet wurden.
   6. Über die Schaltfläche Analysieren | Maße einstellen | Messen Sie Befehle, quantifizieren Sie die Signalintensität innerhalb jedes ROI und exportieren Sie die Messungen als Tabelle (Abbildung 2). Subtrahieren Sie leere ROI-Werte von experimentellen Signalen.
      
   7. Berechnen Sie, wie viel Prozent des ausgeblendeten Signals innerhalb jeder Spur auf ATP und ppGpp zurückzuführen sind, indem Sie die Formeln verwenden.
      HINWEIS: ROIs können mit kommerzieller Software, die mit dem phosphorimager kompatibel ist, oder mit der frei verfügbaren ImageJ-Software (National Institutes of Health) gezeichnet und quantifiziert werden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Vorbereitung der DC-Platten. (A) Die Platten werden in einer Dimension gewaschen, indem die untere Kante in Wasser (blau) gelegt wird. Verunreinigungen (gelb) wandern mit dem Lösungsmittel an die Oberseite der Platte. (B) Nachdem eine Platte vollständig getrocknet ist, wird sie in einer zweiten Dimension gewaschen, indem sie um 90° relativ zur ersten Wäsche gedreht wird und das Wasser e...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Entwicklungstank für Dünnschichtchromatographen (DC)	Allgemeine Glasbläserei	80-3
Polyethylenimin (PEI)-Zelluloseplatten (20 cm x 20 cm, 100 μm Dicke) mit Polyesterträger	Sigma-Aldrich	Z122882-25EA
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml Blei, 100 μCi	Perkin Elmer	NEG002A
Adenosin 5'-triphosphat (ATP) 100 mM	Bio Basic Kanada	AB0311
Guanosin-5'-diphosphat-Dinatriumsalz (GDP)	Alfa Aesar	AAJ61646MC/E
Lagerung Phosphor-Sieb	GE Healthcare Life Sciences	BAS-IP TR 2040 E Tritium-Sieb
Storm 860 Phosphorimager	GE Healthcare Life Sciences	-