1. Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC) zur Semi-Quantifizierung der Menge mehrerer Lipide, einschließlich Cholesterin, Phospholipide und Sphingomyelin
- Bereiten Sie die folgenden vier Lauflösungen und Färbelösungen vor.
- Lösung 1: Mischen Sie Ethylacetat (26,6%), 1-Propanol (26,6%), Chloroform (26,6%), Methanol (26,6%) und Kaliumchlorid (9,6%). Bereiten Sie KCl vor, indem Sie 0,25 g KCl in 100 ml Wasser in HPLC-Qualität auflösen.
- Lösung 2: Mischen Sie n-Hexan (73%), Diethylether (23%) und Zitronensäure (2%).
- Lösung 3: 100% n-Hexan.
- Bereiten Sie die Färbelösung vor, indem Sie destilliertes Wasser (90 ml) mit 7,5 g Kupfersulfat mischen und dann 10 ml Phosphorsäure hinzufügen.
- Füllen Sie bis zu 5 mm jeder Lösung in eine separate Glaskammer. Fügen Sie jede Art von Filterpapier hinzu, um die Laufgeschwindigkeit in jeder Kammer zu erhöhen.
- Eine 20 x 10 cm große HPTLC-Kieselgel-60-Glasplatte in der ersten Lauflösung vorinkubieren, bis die Lauflösung die Oberseite der Platte erreicht. Anschließend 10 min bei 110 °C trocknen.
Anmerkung: Diese Platten können für die zukünftige Verwendung in Aluminiumfolie gelagert und vor der Verwendung 10 min bei 110 °C getrocknet werden.
- Ein Lipidpellet aus Neutrophilen aus dem peripheren Blut des Menschen wird in 200 μl Chloroform/Methanol-Lösung (1:1) aufgelöst und 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, um sich aufzulösen.
- Markieren Sie mit einem Lineal und einem weichen Bleistift die Ladestellen für die gewünschte Anzahl von Proben plus mindestens einen Standard. Markieren Sie die Laufstrecke bei ca. 4 cm bzw. 6 cm für die erste bzw. zweite Lauflösung.
- Um die Proben zu laden, waschen Sie die 10-μl-Spritze 3 Mal in Chloroform/Methanol (1:1), bevor Sie jede neue Probe laden. Laden Sie 10 μl jeder Probe tropfenweise und versuchen Sie, die Probe auf einen möglichst kleinen Bereich zu konzentrieren. Proben sollten mindestens in Duplikaten geladen werden.
- Die Platte wird senkrecht in die erste Kammer mit der Lauflösung 1 geschoben (Schritt 1.1.1). Stellen Sie sicher, dass die Platte parallel zur Wand der Glaskammer verläuft, um eine gleichmäßige Migrationsgeschwindigkeit zu erreichen.
- Sobald die Lösungsmittellinie die erste Markierung erreicht hat, entfernen Sie die Platte, trocknen Sie sie und legen Sie sie in die zweite Lösung. Wiederholen Sie ähnliche Schritte für die zweite und für die dritte laufende Lösung. Lassen Sie die Platte in der Lösung, bis die Lösungsmittelfront die Oberseite der Platte erreicht, nehmen Sie sie dann heraus und trocknen Sie sie 1 Minute lang bei RT
.
- Lege die Platte für 7 s in eine Kupfersulfatlösung. Entferne die Platte, trockne sie gründlich ab und backe sie 7 min bei 170 °C im Ofen. Warte, bis die Platte abgekühlt ist.
- Mit einer Dünnschichtchromatographie- und Gelanalysesoftware sowie einer Bildverarbeitungssoftware können Sie scannen und analysieren, um die aufgelösten Lipidbanden zu identifizieren.
