Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für die Proteinanalyse: Eine Technik zur Trennung und Visualisierung von Proteinen auf der Grundlage des Molekulargewichts

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Sultana, S. et al. Extraktion und Visualisierung von Proteinaggregaten nach Behandlung von Escherichia coli mit einem proteotoxischen Stressor. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video zeigt eine denaturierende Polyacrylamid-basierte Trenntechnik für Proteine. Diese Technik hilft bei der vorläufigen Identifizierung von Proteinen anhand ihres Molekulargewichts.

Protokoll

>1. Trennung und Visualisierung von extrahierten Proteinaggregaten mittels SDS-PAGE

Bereiten Sie ein 12%iges SDS-Polyacrylamid-Gel vor
1. Pipettieren Sie für zwei Trenngele 5,1 mL doppelt destilliertes Wasser (ddH₂O), 3,75 mL Tris-HCl (pH 8,8), 7,5 mL 20 % (w/v) SDS, 6 mL 30 % Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) Lösung, 75 mL 10 % w/v Ammoniumpersulfat und 10 mL Tetramethylethylendiamin (TEMED) in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen und mischen Sie vorsichtig, ohne Luftblasen einzuführen. Gießen Sie das Gel mit einer 1-ml-Pipette in die Glasplatten und lassen Sie die oberen 2 cm frei von der Mischung. Geben Sie 70% Ethanol auf das Trenngel und sorgen Sie für eine gleichmäßige Grenzfläche zwischen den beiden Schichten.
2. Nach der Polymerisation des Trenngels bereiten Sie das Stapelgel vor, indem Sie 1,535 ml ddH₂O, 625 ml Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 ml 20 % (w/v) SDS, 335 ml 30 % Acrylamid/Bisacrylamid (29:1)-Lösung, 12,5 ml 10 % w/v Ammoniumpersulfat und 2,5 ml TEMED pipettieren. Entfernen Sie das Ethanol aus den Trenngelen und fügen Sie die Stapelgellösung hinzu. Führen Sie einen Kamm mit der gewünschten Anzahl von Taschen ein, ohne Luftblasen einzuführen. Lassen Sie die Polymerisation 20-30 min einwirken.
Laden Sie 4 μl jeder Probe und Proteinleiter in separate Vertiefungen und lassen Sie das/die Gel(e) in Tris-Glycin-Laufpuffer (Tabelle 1) bei 144 V für 45 min bei Raumtemperatur laufen.
Anmerkung: Stoppen Sie das Gel, wenn die Bromphenolbande aus dem Gel zu wandern droht.
Färben Sie das/die Gel(e) in einer vorgewärmten Fairbanks-Lösung A (Tabelle 1) für 30 Minuten auf einer Wippe.
Das/die Gel(e) in einer vorgewärmten Fairbanks-Lösung D (Tabelle 1) auf einer Wippe bis zum gewünschten Hintergrund (z. B. über Nacht) einfärben.

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Ergebnisse

Lösungen	Rezepte
Puffer A	10 mM Kaliumphosphat (pH 6,5), 1 mM EDTA
Puffer B	Puffer A mit 2 % Nonidet P-40. Kann für den späteren Gebrauch bei Raumtemperatur gelagert werden.
Fairbanks A (Färbelösung)	25% Isopropanol, 10% Eisessig, 1,4 g Coomassie R-250

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