$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Dieses Protokoll wurde von der University of Rochester Ausschuss sich mit der ethischen Verwendung von Tieren in der Forschung (UCAR) zugelassen. Aseptische Techniken sollten in das Protokoll befolgt werden. Die Verwendung von sterilen Handschuhen und einer Maske erforderlich ist.
Alle Geräte, Materialien, Chemikalien und Werkzeuge, die während des Protokolls verwendet werden, sind in Tabelle 1 beschrieben.
1. Präoperative Vorbereitung
- Inject Mäusen subkutan mit Buprenorphin (0.05mg/kg) 2 h vor der Operation, unmittelbar nach der Operation und dann alle 3-5 h während der ersten 24 h postoperativen Phase.
- Sterilisieren aller chirurgischen Instrumente, Gaze Schwämme und Wattestäbchen Applikatoren von Autoklaven. Halten Sie chirurgische Instrumente in 70% igem Ethanol während der Operation und an der Luft trocknen auf steriler Gaze rechts vor dem Gebrauch. Sprühen Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol.
- Anesthetize der Maus mit 3% Isofluoran-20% Sauerstoff-Gasgemisch durch ein Betäubungsmittel Verdampfer. Passen Sie die Sauerstoffmenge mit dem Durchflussmesser. Testen Sie das Niveau der Anästhesie durch Zehe oder Schwanz kneifen (sie sollten nicht mehr reagiert). Halten Sie das Niveau der Anästhesie mit 2% (v / v) Isofluoran.
- Bewerben künstliche Tränen, um die Maus in die Augen und seien Sie vorsichtig, um eine Beschädigung des Auges während der Operation. Platzieren Sie die Maus auf der rechten Seite in eine seitliche Position.
- Shave Bereich auf der linken Seite zwischen dem linken Auge und die Basis des linken Ohres mit dem Tierschermaschinen. Reinigen Sie die Fläche durch den Wechsel zwischen einem betadine-Lösung und 70% Ethanol mit Wattestäbchen Applikatoren und leichtes Reiben der Gegend. Bei Bedarf wiederholen.
- Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen an eine rektale Sonde auf Körpertemperatur bei 37 ° C zu halten Legen Sie die rektale Sonde mit Mineralöl.
- Bewegen Sie die Maus auf der rechten Seite unter dem Mikroskop und sicher mit Klebeband. Schneiden Sie ein Fenster in einem Gaze-Schwamm und Abdeckung OP-Bereich.
2. Chirurgische Verfahren und MCA Ligation
- Machen Sie einen vertikalen Einschnitt zwischen dem linken Auge und die Basis des linken Ohres mit feinen geraden Schere. Verwenden Sie gebogenen Hämostatika zu halten OP-Bereich zu öffnen.
- Machen Sie ein horizontaler Schnitt auf der Schläfenmuskels mit Feder Schere und etwas trennen Schläfenmuskels aus dem Schädel durch langsames Ziehen mit der Pinzette.
- Machen Sie eine kleine subtemporal Kraniotomie an der Kreuzung der Jochbogen und Squamosum durch Verwendung einer 18G Nadel, während der Kieferknochen mit einer gebogenen Pinzette.
- Expose der MCA durch das Entfernen der kleine Schädel mit Knochen Rongeure. Der Jochbogen und Orbital Inhalte sollten dabei nicht beschädigt werden. Wenn übermäßige Trocknung des Gewebes auftritt, während dieses Prozesses, steriler PBS mit Wattestäbchen Applikatoren.
- Ligieren des distalen Teil der MCA mit einem kleinen Schiff cauterizer.
- Legen Sie die Schläfenmuskels wieder in seine ursprüngliche Position und schließen Sie die Inzisionsstelle mit chirurgischen 5-0 Nylonnaht.
- Unterbrechen Sie Anästhesie und entfernen Sie die rektale Sonde. Spritzen Sie die Maus mit einer 2. Dosis von Buprenorphin (0.05mg/kg) subkutan. Bringen Sie die Maus, um den Käfig, der auf 37 ° C wurde mit einer Heizplatte.
- Genau beobachten, mit der Maus für die nächsten 24 h für alle Beschwerden (Appetitlosigkeit / Wasserverbrauch, gekrümmte Haltung, beschleunigte Atmung, Pilo-errichtet Haare). Spritzen Sie die Maus mit Buprenorphin subkutan alle 3-5 h nach der Operation bis zu 24 Stunden. Geben Sie die Maus mit Recovery-Gel in diesem Zeitraum.
3. TTC-Färbung und Bestimmung der Stroke Volume
- Vierundzwanzig Stunden nach der Operation tief betäuben die Maus, transkardial perfuse der Maus mit 4% TTC (w / v) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 15 min und dann mit einer 4% Paraformaldehyd-Lösung für 10 min mit einem Mini-Schlauchpumpe bei mittlerer Strömungsgeschwindigkeit. Entfernen Sie das Gehirn und legen Sie sie in die 4% Paraformaldehyd-Lösung über Nacht.
- Position des Gehirns in die Schnitte zu blockieren. Scheiben des Gehirns in 1mm dicke Scheiben schneiden mit Rasierklingen.
- Legen Sie die Scheiben neben einer Millimeter-Skala Lineal. Fotografieren Sie die Scheiben mit einer Digitalkamera mit dem Binokular.
- Berechnen Sie den Hubbereich durch Subtraktion der nicht-Infarktareal der ipsilateralen Seite von der Gesamtfläche der kontralateralen Seite mit Image J Software (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Berechnen Sie das Hubvolumen durch Stapeln der Hubbereich der Scheiben 22.
4. Anfahrt zu nutzen Image J Software
- Öffnen Sie die Bilddatei in Image J Software, indem Sie auf das Menü Datei analysiert werden.
- Klicken Sie auf den "geraden Linie" Tab im Programm. Zeichnen einer geraden Linie zwischen den beiden Rändern auf dem Lineal. Klicken Sie auf "Analyse"-Menü und wählen Sie 'set scale'. Set dem bekannten Abstand als 1, Einheit der Länge als mm.
- Klicken Sie auf "Freihand Kreis-Register. Zeichne einen Kreis um die kontralateralen Hemisphäre zu skizzieren. Klicken Sie auf "Analyse"-Menü und wählen Sie "Maßnahme". Die Berechnung Fenster öffnet sich, welche die Fläche des Kreises gezogen.
- Draw noch ein Kreis um den ipsilateralen Hemisphäre ohne Hub (weiss) Bereich. Man misst die Fläche, wie in Schritt 4.3 angegeben. Der neue Wert wird auf die Berechnung Fenster hinzugefügt werden. Der Unterschied zwischen der 1. und 2. Werte stellt den Bereich des Infarktes, die als A in der folgenden Formel angegeben ist.
- Berechnen Sie den Hubbereich in jeder Scheibe durch Wiederholen der Schritte 4,2-4,4. Nehmen Summation der Hubbereich in jede Scheibe (ΣA n) berechnet. Dies entspricht Hubvolumen Kenntnis der Tatsache, dass die Dicke jeder Scheibe 1mm ist.
ΣA n x 1mm (Dicke jeder Scheibe) = Hubvolumen
5. Repräsentative Ergebnisse:
Die Infarkte durch permanente MCA Ligation in der Maus gewonnen werden meist kortikalen. Allerdings ist es möglich, subkortikale Läsionen zu erhalten, wenn der MCA ist ligiert proximal des lentikulostriatalen Branche. Das Hubvolumen nach MCA Ligation könnte von 10mm bis 35mm ³ ³ 19, 23 variieren. Das Hubvolumen mit TTC-Färbung in Moyanova et al. 19 sind zwischen 10mm bis 22mm ³ ³, während die Hubvolumen von MRT-Bildern in Filiano et al 23 sind zwischen 20 mm ³ bis 35mm ³ bestimmt. Ein möglicher Grund für diese Unterschiede vielleicht die genaue Lage der Ligation und die verschiedenen Methoden verwendet, um die Hubvolumen zu messen.
In Abbildung 1 ist ein TTC gefärbt Gehirn 24 Stunden nach dauerhaften MCA Ligation in einem Wildtyp-C57/BL6 Maus gezeigt. Der Hub Site ist weiß in Erscheinung (Abb. 1A, B). Abbildung 1A und B zeigen die Infarkt Ort aus verschiedenen Blickwinkeln. Abbildung 2 zeigt 1mm dicke Scheiben des TTC gefärbt Schlaganfall Gehirn von vorne nach hinten (Abb. 2A-G). Infarktvolumen berechnet wurde 24 h nach der Operation. Das Volumen des Infarkts ist ~ 23mm ³.
Abbildung 1. Vertretung von Schlaganfallpatienten vor Ort. AB, gebeizt TTC ganze Gehirn Bilder, 24 h nach der MCA-Ligation. Weiß-Bereich stellt die Infarkt.
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse. (A> G), TTC gefärbt 1mm Hirnschnitten, 24 h nach MCAL. Scheiben sind von vorne nach hinten ausgerichtet. Weiß-Bereich stellt die Infarkt.