Multianalyt-Immunobead-Assay: eine flussbasierte Immunoassay-Technik zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Antikörper-Subtypen in humanen Serumproben

Zusammenfassung

Quelle: Fhied, C. L. et al., Dynamische Überwachung der Serokonversion mit einem Multianalyt-Immunbead-Assay für Covid-19. J. Vis. (2022).

Dieses Video beschreibt eine Immunoassay-Technik, bei der fluoreszierende magnetische Kügelchen oder Mikrosphären in Verbindung mit verschiedenen Antigenen verwendet werden, um gleichzeitig verschiedene Antikörper-Isotypen in einer Serumprobe nachzuweisen. Der Assay ist hilfreich, um die Serokonversion während einer Infektion oder nach der Impfung zu verstehen.

Protokoll

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

1. Herstellung von Antigen-konjugierten Mikrosphären

1. Wählen Sie drei verschiedene Fläschchen mit magnetischen Mikrosphären mit einzigartigen Bead-Bereichen aus und erfassen Sie die Bead-ID und die Chargeninformationen für jedes verwendete Fläschchen.
   Anmerkung: Die folgenden Schritte werden für jede einzelne Mikrosphärenregion ausgeführt. Mikrosphären sind lichtempfindlich und sollten vor längerer Lichteinwirkung geschützt werden. Achten Sie bei den Waschschritten darauf, die Mikrokügelchen nicht zu stören. Bei Störung einen zweiten Abstand von 60 s einplanen.
2. Den Mikrosphärenstoff 60 s lang vortexen und 5 Minuten vor der Verwendung beschallen, um aggregierte Kügelchen zu dissoziieren.
3. Übertragen Sie 1,0 x 10⁶ Kügelchen auf ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung.
4. Setzen Sie das Rohr in einen Magnetabscheider ein und lassen Sie die Trennung 60 s lang erfolgen. Während sich das Rohr noch im Magnetabscheider befindet, entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Perlpellet zu stören.
5. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetabscheider, resuspendieren Sie die Kügelchen mit 100 μl Wasser in HPLC-Qualität und wirbeln Sie es 30 s lang ein. Setzen Sie das Röhrchen wieder für 60 s in den Magnetabscheider ein und entfernen Sie anschließend den Überstand. Wiederholen Sie dieses Waschprotokoll zweimal.
6. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetabscheider und resuspendieren Sie die gewaschenen Mikrosphären in 90 μl 100 mM monobasischem Natriumphosphat, pH 6,2 (Aktivierungspuffer) durch Wirbel für 30 s.
7. Geben Sie 10 μl 50 mg/ml Sulfo-NHS (verdünnt mit Aktivierungspuffer) zu den Mikrosphären und wirbeln Sie sie 10 s lang sanft ein. Fügen Sie 10 μl 50 mg/ml EDC-Lösung (verdünnt mit Aktivierungspuffer) hinzu und wirbeln Sie sie 10 s lang sanft auf. Inkubieren Sie die Mikrosphären 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) mit einem sanften Vortex alle 10 Minuten.
8. Wiederholen Sie die Waschschritte 1.4-1.5 mit 50 mM MES, pH 5,0 (Coupling Buffer) anstelle von LC/MS-Wasser für insgesamt zwei Wäschen.
9. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetabscheider und resuspendieren Sie die Kügelchen mit 100 μl Kupplungspuffer durch Vortex für 30 s, gefolgt von der sofortigen Zugabe der gewünschten Proteinmenge.
10. Bringen Sie das Gesamtvolumen mit dem Kopplungspuffer auf 150 μl. Kopplungsreaktion durch Vortex für 30 s mischen und 2 h durch Rotation bei RT.
    inkubieren Anmerkung: Für die hierin definierten Assays wurden Konjugationen mit den folgenden Proteinkonzentrationen durchgeführt: Spike S1: 5 μg; Nukleokapsid: 5 μg; Membran: 12,5 μg.
11. Wiederholen Sie den Waschschritt 1.4 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)-1 % Ziegenserumalbumin, 0,01 % Polysorbat-20 (Quench-Puffer) anstelle von Wasser in LC/MS-Qualität für insgesamt zwei Wäschen. Resuspendieren Sie die gewaschenen Mikrosphären in 100 μl Quench-Puffer mit 0,05 % Natriumazid durch Vortex für 30 s.
    Anmerkung: Lassen Sie die Kügelchen mindestens 6 Stunden lang vollständig abschrecken, bevor Sie mit einem anderen Verfahren fortfahren.
12. Zählen Sie die Anzahl der zurückgewonnenen Mikrosphären mit einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämozytometer. Notieren Sie die beobachtete Kügelchenkonzentration.
13. Die gekoppelten Mikrosphären bei 4 °C im Dunkeln kühlen.

2. Prozeduren

1. Assay-Leistung (Basisprotokoll)
   1. Resuspendieren Sie die gekoppelten Mikrosphären durch Wirbel für 30 s und beschallen Sie sie für ~60-90 s.
   2. Entnehmen Sie die erforderliche Menge jedes Bead-Kolloids aus dem jeweiligen Röhrchen und kombinieren Sie die Bead-Kolloide in einem neuen 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen.
   3. Setzen Sie das Röhrchen in einen Magnetabscheider ein und lassen Sie die Trennung 60 Sekunden lang erfolgen. Während sich das Rohr noch im Magnetabscheider befindet, entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Perlpellet zu stören.
   4. Entfernen Sie die Kügelchen aus dem Separator, resuspendieren Sie die Kügelchen mit 100 μl PBS-1 % Rinderserumalbumin, 0,01 % Polysorbat-20 (Assay-Puffer) und wirbeln Sie sie 30 s lang ein. Stellen Sie das Röhrchen in einen Magnetabscheider und lassen Sie die Trennung 60 s lang erfolgen. Wiederholen Sie dieses Waschprotokoll (d. h. die Schritte 2.1.3-2.1.4) zweimal.
   5. Passen Sie die Konzentration der 3-Plex-Arbeitsmikrosphärenmischung an, indem Sie ein geeignetes Volumen Assay-Puffer hinzufügen, um eine Endkonzentration von 100 Mikrosphären pro 1 μl für jedes Ziel zu erzeugen.
   6. Aliquotieren Sie 12,5 μl der in Schritt 2.1.5 hergestellten Mikrosphärenmischung in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte oder 25 μl in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.
   7. Verdünnen Sie die Plasma-/Serumproben 500-fach in Assay-Puffer. Bereiten Sie Standardproben entsprechend der gewünschten Titration vor.
   8. Geben Sie 12,5 μl Assay-Puffer als Blindprobe hinzu und geben Sie jede verdünnte Probe oder jeden Standard in jede dafür vorgesehene Vertiefung einer 384-Well-Probenplatte oder 25 μl der blinden, verdünnten Probe oder des Standards in jede Vertiefung einer 96-Well-Probenplatte.
   9. Decken Sie die Platte mit einem Aluminiumsiegel oder einer Folie ab und inkubieren Sie sie 1 h lang bei RT auf einem Plattenschüttler, der auf 700 U/min eingestellt ist.
      Anmerkung: Das Schema für die Verdünnungskurven ist in Tabelle 1 dargestellt.
   10. Eine Lösung von Anti-Human-Nachweisantikörpern (Sekundärantikörperlösungen) bei 4 μg/ml mit Assay-Puffer gemäß Schritt 2.1.11 herstellen.
   11. Bereiten Sie Ziegen-Anti-Human-IgM vor, konjugiert mit Super Bright 436 (SB)/Ziegen-Anti-Human-IgA, Phycoerythrin (PE)-Konjugat-Nachweis-Antikörpern bei 4 μg/ml; oder Ziegen-Anti-Human-IgM, SB-Konjugat/Ziegen-Anti-Human-IgG, PE-Konjugat-Nachweis-Antikörper bei 4 μg/ml.
       Anmerkung: Für ein 384-Well-Plattenformat sind 12,5 μl/Well der vorbereiteten Sekundärantikörperlösung erforderlich, und für ein 96-Well-Plattenformat sind 25 μl/Well erforderlich.
   12. Legen Sie die Platte auf einen Magnetabscheider, waschen Sie sie schnell und drehen Sie sie kräftig über einen Behälter für biologische Gefahren, um Flüssigkeit aus den Vertiefungen zu entfernen. Während die Platte noch umgedreht ist, klopfen Sie mit Gewalt gegen ein dickes Papierbündel.
   13. Waschen Sie jede Vertiefung mit 100 μl Assay-Puffer und entfernen Sie die Flüssigkeit durch gewaltsame Inversion über einem Behälter für biologische Gefahren, wie zuvor beschrieben. Wiederholen Sie diese Schritte (2.1.12-2.1.13) für insgesamt zwei Wäschen. Entsorgen Sie alle gebrauchten Papierklumpen in einen Behälter für biologische Gefahren.
   14. Geben Sie 12,5 μl der Sekundärantikörper-Arbeitslösung in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte oder 25 μl in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Decken Sie die Platte mit einem Aluminiumsiegel oder einer Folie ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei RT auf einem Plattenschüttler, der auf 700 U/min eingestellt ist.
   15. Wiederholen Sie die Waschschritte 2.1.12-2.1.13.
   16. Geben Sie 75 μl Assay-Puffer in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte oder 100 μl in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Decken Sie die Platte mit einem Aluminiumsiegel oder einer Folie ab und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei RT auf einem Plattenschüttler, der auf 700 U/min eingestellt ist.
   17. Analysieren Sie 60 μL über den Geräteanalysator gemäß dem Systemhandbuch.

Tabelle 1: Verdünnungsreihe für Standardkurven: Tabelle der Verdünnungsfaktoren, die für die Standardkurven für den IgG-Serotyp verwendet wurden; dargestellt als 7-Punkt, 1:5 serielle Verdünnungskurve beginnend bei 1 μg/ml für α-Spike S1 und α-Nukleokapsid und 5 μg/ml für α-Membran-Antikörper.

kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg

Normnummer	Verdünnungs-Reihen	Anti-Spike S1 oder N (μg/ml)	Anti-Membran (μg/ml)
leer	leer	-	-
1	STD7 1:1	1	5
arabische Ziffer	STD6 1:5	0,2	1
3	STD5 1:25	0,04	0,2
4	STD4 1:125	0,008	0,04
5	STD3 1:625	0,0016	0,008
6	STD2 1:3125	0,00032	0,0016
7	STD1 1:15625	0,000064	0,00032

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
384-Well-Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit schwarzer Seite	Thermo Fischer	Tel.: 12-565-346
Aktivierungspuffer (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2)	Im Haus zubereitet
Assay-Puffer (PBS, 1 % Rinderserumalbumin, 0,01 % Polysorbat-20)	Im Haus zubereitet
Rinderserumalbumin, Hitzeschockfraktion	MilliporeSigma	A-7888-50G
Kopplungspuffer (50 mM MES, pH 5,0)	Im Haus zubereitet
COVID 19 M Coronavirus Rekombinantes Matrixprotein (6xHistag)	MyBioSource	MBS8574735
Einweg-Pipettenspitzen
EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidhydrochlorid)	Thermo Fischer	PIA35391
Ziegenalbumin, Fraktion V Pulver	Millipore Sigma	Nr. A2514-1G
IgA-Ziege Anti-Mensch, R-PE, Polyklona	Thermo Fischer	OB205009
IgG Ziege Anti-Mensch, R-PE, Polyklonal	Thermo Fischer	OB204009
IgG Ziege Anti-Kaninchen, R-PE, Polyklonal	Thermo Fischer	OB403009
gM Ziege Anti-Human, R-PE, Polyklonal	Thermo Fischer	OB202009
IgM Maus Anti-Mensch, SB 436, Klon SA-DA4	Thermo Fischer	62999842
Instrumenten-Analysator	Luminex Corp.	INTELLIFLEX-RUO
Low-Bind-Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL)	Thermo Fischer	Tel.: 13-698-794
MagPlex-C Mikrosphären, Region XXX	Luminex Corp.	MC10XXX-01
MES-Hydrat (2-(N-Morpholino)-Ethansulfonsäurehydrat)	MilliporeSigma	Nr. M2933
Mikroplatten-Aluminium-Dichtungsband	Thermo Fischer	Tel.: 07-200-683
Polysorbat-20	Thermo Fischer	Nr. BP337-500
Quality Biological Inc. PBS, pH 7,2	Thermo Fischer	Tel.: 50-751-7328
Quench-Puffer (PBS, 1 % Ziegenserumalbumin, 0,01 % Polysorbat-20)	Im Haus zubereitet
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nukleokapsid-Protein (His-Tag)	Sino Biologicals	40588-V08B
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike-Protein (S1-Untereinheit, His-Tag)	Sino Biologicals	40591-V08H
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antikörper, Kaninchen pAb	Sino Biologicals	Artikel-Nr.: 40592-T62
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nukleokapsid-Antikörper, Kaninchen mAb	Sino Biologicals	Artikel-Nr.: 40588-R0004
SARS-CoV-2 (COVID-19) Membran-Antikörper (IN), Kaninchen pAb	ProSci	Nr. 10-516
Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid)	Thermo Fischer	PIA39269
Waschpuffer (PBS, 0,01 % Polysorbat-20)	Im Haus zubereitet
Wasser, LC/MS-Qualität	Thermo Fischer	W-64