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1. Sammlung von Organismen
- Seeanemone A. dowii sammeln.
HINWEIS: Hier wurden die Organismen während Niedrigwasserperioden in der Gezeitenzone vor der Küste von Ensenada Baja, Kalifornien, Mexiko gesammelt (Abbildung 1A, B).
- Transportieren Sie die Organismen in Behältern mit Meerwasser ins Labor (Abbildung 1C).
- Reinigen Sie die Organismen im Labor mit destilliertem Wasser von Hand, um die großen Substratpartikel zu entfernen, die am Körper haften.
- Frieren Sie die Organismen sofort bei -80 °C im Ultratiefkühlschrank für 72 h ein.
- Die Organismen werden zur Gefriertrocknung in spezielle Gläser mit Gefriertrocknung bei Gefriertrocknungsbedingungen von -20 °C, 0,015 psi, für 48 h gelegt.
- Lagern Sie die lyophilisierten Organismen bis zur Verwendung bei -20 °C.
2. Hydratation des Gewebes
- Rekonstituieren Sie 20 g Trockengewicht lyophilisierter Organismen mit 60 ml (1/3 w/v) 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 und 1 Inhibitor-Cocktailtablette (Materialtabelle).
- Rühren Sie die Probe in einem Magnetrührer 12 Stunden lang kontinuierlich bei ~800 U/min, 4 °C.
3. Freisetzung von Toxinen
- Um die Zelllyse und den Nematozystenausfluss zu induzieren, frieren Sie die Probe 12 Stunden lang bei -20 °C ein und stellen Sie den Behälter dann in Wasser bei Raumtemperatur (RT), bis er auf 90 % aufgetaut ist. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.
Anmerkung: Die Probe taut nicht zu 100 % auf; Es ist wichtig, die Probe bei ~4 °C zu halten, um einen Proteinabbau zu verhindern.
- Beobachten Sie die Nematozyste, die sich unter einem konfokalen Mikroskop ausscheidet. Entnehmen Sie 10 μl der Probe auf einem Objektträger und legen Sie ein Deckglas darüber. Beobachten Sie unter einem konfokalen Mikroskop bei 100- und 60-facher Vergrößerung. Hier war ein Färben nicht notwendig.
- Verarbeiten Sie die mit dem Konfokalmikroskop aufgenommenen Bilder in der ImageJ-Software (Version 1.53c, Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij).
- Wenn sich der Tubulus im Inneren der Nematozyste abwickelt und sich außerhalb befindet, werden die Nematozysten entladen. Fahren Sie dann mit dem nächsten Schritt fort. Andernfalls führen Sie nur noch einen weiteren Frost-Tau-Zyklus durch.
- Um den Extrakt zu klären, zentrifugieren Sie die Probe bei 25.400 x g für 40 min, 4 °C, gewinnen Sie den Überstand zurück und zentrifugieren Sie ihn erneut. Wiederholen Sie diesen Schritt 3-4 Mal.
- Den Überstand bergen und das Pellet entsorgen. Der Überstand oder Rohextrakt enthält die Giftbestandteile (Toxine) und andere Zellmoleküle wie Lipide, Kohlenhydrate und Nukleinsäuren.
4. Quantifizierung des Gesamtproteins
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentration des Rohextrakts mit einem kommerziellen kolorimetrischen Assay-Kit von Bradford (Materialtabelle).
- Verdünnen Sie das Farbstoffreagenz (einen Teil des Farbstoffs mit vier Teilen destilliertem Wasser).
- Bereiten Sie die Lösung für Rinderserumalbumin (BSA) der Fraktion V (Materialtabelle) in einer Konzentration von 1 mg/ml in Phosphatpuffer (50 mM Natriumphosphat, pH 7,5) auf.
- Bereiten Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Lösungen in dreifacher Ausfertigung vor.
- Jede Lösung in einem Shaker 4 s lang kräftig mischen.
- Inkubieren Sie die Proben 5 Minuten lang bei RT, ohne zu schütteln.
- Messen Sie die Absorption (AU) bei 595 nm.
- Zeichnen Sie die Durchschnittswerte der BSA-Absorptionen der Probe (AU vs. Proteinkonzentration) und bestimmen Sie die Gleichung des Diagramms (Gleichung 1).
Dabei ist y die Absorption, m die Steigung der Linie, x die Proteinkonzentration und b der y-Achsenabschnitt. Um die Rohextraktkonzentration zu berechnen, lösen Sie wie folgt nach x auf:
5. Bestimmung der Komplexität des Polypeptidgiftes
- Montieren Sie den Glasbehälter für die vertikale Gelelektrophorese gemäß der Anleitung.
- Bereiten Sie die Acrylamidmischung (30%) vor: 29,2 g Acrylamid, 0,8 g Bis-Acrylamid, das Endvolumen von 100 ml. Filtrieren Sie die Lösung mit einer 0,45 μm Membran. Lagern Sie die Lösung in einer dunklen Flasche bei 4 °C. Bereiten Sie dann die Mischung für das auflösende Gel vor (Tabelle 2).
- Das SDS-PAGE Gel besteht aus einem auflösenden Gel und einem Stapelgel. Bereiten Sie die Gele gemäß den in Tabelle 2 definierten Lösungsvolumina vor. Während der Zubereitung ist darauf zu achten, dass jede Mischung bei 4 °C gehalten wird, um die Polymerisationszeit zu verkürzen.
Anmerkung: Das Volumen jeder Mischung variiert je nach Marke der verwendeten Ausrüstung; Für dieses Protokoll entsprechen die Volumina der Herstellung von 15%igem Acrylamidgel mit einer Dicke von 0,75 mm für eine vertikale Elektrophoresekammer (Materialtabelle).
- Nachdem das Acrylamid polymerisiert ist, ~10 min, fügen Sie die Mischung aus Stapelgel hinzu.
- Bereiten Sie die Mischung für das Stapelgel vor, geben Sie sie sofort auf die Glasplatten und legen Sie einen Kamm in die Vertiefungen zum Laden der Proben.
- Sobald das Stapelgel polymerisiert ist (~15 min), entfernen Sie den Kamm und stellen Sie den Glasbehälter zur vertikalen Elektrophorese in eine Kammer.
- Geben Sie 200 ml Elektrodenpuffer (0,25 M Tris, 0,192 M Glycin, 0,1 % SDS) in die Elektrophoresekammer.
- Analysieren Sie den Rohextrakt: Mischen Sie 30 μg Rohextrakt mit 5 μl Proteinladepuffer (25 % Glycerin, 15 % Natriumdodecylsulfat, 25 % 2-Mercaptoethanol, 0,125 mM Tris pH 7, Bromphenolblau 0,1 mg/ml), um Proteine zu denaturieren. Das Endvolumen muss <50 μl betragen.
- 5 min auf 90 °C erhitzen, abkühlen lassen und 3 s bei 1.400 x g zentrifugieren. 10. Laden Sie die Proben in die Vertiefungen des Stapelgels. Laden Sie eine Standard-Molekulargewichtsleiter.
- Laden Sie die Proben in die Vertiefungen des Stapelgels. Laden Sie eine Standard-Molekulargewichtsleiter.
- Die Elektrophorese bei einer Konstante von 25 mA für 1 h 30 min laufen lassen.
- Nehmen Sie die Glasbehälter aus der Elektrophoresekammer, um mit der Färbung der Gelproteine fortzufahren.
6. Protein-Färbung
- Spülen Sie das Gel in 50 ml destilliertem Wasser ab, um Schmutz von der Pufferelektrode zu entfernen.
- Entsorge das Wasser.
- Um die Diffusion der Gelproteine zu vermeiden, fügen Sie die Fixierlösung hinzu (60 mL Ethanol, 20 mL Essigsäure und 20 mL destilliertes Wasser, Endvolumen 100 mL). 40 min bei RT inkubieren und bei 80 U/min schütteln. Dekantieren Sie die Lösung.
- Fügen Sie die Proteinvernetzungslösung (15 mL Ethanol, 0,25 mL Glutaraldehyd, 50 mL destilliertes Wasser, Endvolumen 65,25 mL) hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei RT und Schütteln bei 80 U/min. Entfernen Sie die Lösung.
- Waschen Sie das Gel 5 Minuten lang mit 100 ml destilliertem Wasser und entfernen Sie das Wasser. Wiederholen Sie diesen Vorgang viermal.
- Führen Sie die Proteinfärbung mit 50 mL Coomassie Brilliant Blue R-250 filtrierter Lösung (40 % Methanol, 10 % Essigsäure, 50 % destilliertes Wasser, 0,1 % Farbstoff, Endvolumen 100 mL) durch und rühren Sie bei 60 U/min in einem Laborrotator-Rotationsoszillator bei RT für 15 min.
- Stellen Sie die Lösung wieder her, die zum Färben anderer Gele verwendet werden kann.
- Um den überschüssigen Farbstoff zu entfernen, fügen Sie eine Entfärbungslösung hinzu (40 ml Methanol, 10 ml Essigsäure, 50 ml destilliertes Wasser). Rühren Sie weiter (80 U/min) bei RT, bis die Banden (gefärbte Proteine) sichtbar sind.
- Bewahren Sie das Gel in 50 ml destilliertem Wasser auf und scannen Sie das Bild in einem Gel-Dokumentationssystem.
7. Phospholipase-Assay
- Waschen Sie ein Hühnerei mit 1 % SDS in destilliertem Wasser.
- Das Eigelb vom Eiweiß steril trennen.
- Bereiten Sie 50 ml 0,86%ige NaCl-Lösung vor und filtrieren Sie durch einen 0,22-μm-Filter. Bereiten Sie dann Lösung A vor: Fügen Sie 12 ml Eigelb und 36 ml 0,86%ige NaCl-Lösung hinzu.
- Lösung B vorbereiten: 300 mg Agarose in 50 ml Puffer (50 mM Tris, pH 7,5) mischen und durch einen 0,22 μm Filter filtrieren. Die Lösung in der Mikrowelle erhitzen, bis sie kocht. In warmem Wasser auf 43-45°C abkühlen lassen.
- Lösung C vorbereiten: 10 mM CaCl2 vorbereiten und mit einem 0,22 μm Filter filtrieren.
- Bereiten Sie Lösung D vor: 10 mg Rhodamin 6 G in 1 ml destilliertem Wasser.
- Unter sterilen Bedingungen (Laminar-Flow-Haube) 500 μl der Lösungen A und C zu Lösung B und 100 μl der Lösung D hinzufügen, mischen und 25 ml in jede Petrischale (90 x 15 mm) gießen.
- Warten Sie, bis sich die Lösung unter sterilen Bedingungen verfestigt hat (30 min).
- Bohren Sie Vertiefungen (~2-3 mm Durchmesser) mit einem dünnen Rohr.
- Geben Sie insgesamt 20 μl Phosphatpuffer (Negativkontrolle) in eine Vertiefung und 20 μl einer bestimmten Phospholipase (Positivkontrolle) in eine andere Vertiefung
.
- Unterschiedliche Mengen des Rohextraktproteins (5, 15, 25, 35, 45 μg) werden in die verbleibenden Vertiefungen gegeben, jeweils in einem Endvolumen von 20 μl.
- Warten Sie, bis der Agar alle Proben adsorbiert hat (30 min).
- 20 h bei 37 °C inkubieren.
- Bildet sich ein Halo um die Vertiefung, deutet dies auf Phospholipase-Aktivität hin. Messen Sie den mit einem Messschieber gebildeten Halo.
Anmerkung: Führen Sie das Experiment in dreifacher Ausfertigung durch (Schritte von 7.1-7.14).
