1. Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) Stempeln
- Zeichnen Sie mit einer CAD-Software ein Array von mikroskaligen Ringen mit einem Innendurchmesser von 250 μm und einem Außendurchmesser von 450 μm. Das in diesem Protokoll verwendete Muster ist ein 10 x 10 Array mit einem Abstand von 850 μm zwischen den Ringen.
- Drucken Sie eine Durchlichtmaske des Musters in der gewünschten Auflösung mit dem Maskendruckservice eines Mikrofabrikationsunternehmens (siehe Materialtabelle).
Anmerkung: Die angegebenen Abmessungen des Rings haben sich für viele Zelltypen bewährt.
- Führen Sie eine ultraviolette (UV) Photolithographie mit der Maske durch, die die gewünschten Merkmale enthält, um eine negative Fotolackform (z. B. SU-8) herzustellen.
- Einen mit Fotolack schludernden Siliziumwafer wird mit der in den Schritten 1.1 bis 1.2 hergestellten Durchsichtigkeitsmaske abgedeckt.
- Polymerisieren Sie auf einem UV-Kontakt-Aligner den Fotolack unter transparenten Bereichen der Maske durch UV-Licht.
Anmerkung: Nach weiterer Wäsche und Entwicklung wird die Urform mit den gewünschten Eigenschaften hergestellt. Die Betriebsdetails hängen von der verwendeten Ausrüstung ab.
- Bereiten Sie PDMS-Elastomer-Präpolymere vor, indem Sie mit seinem Härter im Verhältnis 10:1 mischen und dann die Mischung in einer Petrischale auf die Form gießen.
- Die Form für 30 min in eine Vakuumkammer stellen, um Luftblasen im PDMS zu entfernen, und im Backofen bei 60 °C mindestens 2 h backen.
- Nach dem vollständigen Aushärten von PDMS schneiden Sie die Musterarrays in Stempel.
Anmerkung: Dickere Stempel (ca. 1 cm) können aufgrund der einfachen Handhabung in den späteren Schritten des Mikrokontaktdrucks bevorzugt werden.
2. Beschichtung von Objektträgern
- Reinigen Sie die Objektträger. Weichen Sie die Objektträger in einem 100%igen Ethanolbad ein, beschallen Sie sie 5 Minuten lang und spülen Sie sie dann mit Wasser ab.
- Wiederholen Sie diesen Schritt zuerst mit Aceton, dann mit Isopropanol, gefolgt von der Trocknung in einem Stickstoffstrom.
- Verwenden Sie ein Elektronenstrahl-Verdampfungsgerät (E-Beam), um Titan- und Goldschichten auf Objektträgern zu beschichten.
Anmerkung: Für die Titanschicht beträgt die gewünschte Dicke 15 Å (1 Å = 10-10 m). Für die Goldschicht beträgt die gewünschte Dicke 150 Å. Beschichten Sie zuerst Titan und dann Gold, da die Titanschicht als Klebstoff zwischen Gold und dem Objektträger dient.
- Legen Sie die gereinigten Objektträger in die Verdampfungskammer und setzen Sie Gold- und Titantiegel unter die Klappen ein.
- Pumpen Sie die Kammer nach unten, um ein Vakuum von weniger als 10-5 Pa zu erzeugen, bevor Sie Metalle schmelzen. Fokussieren Sie den Elektronenstrahl auf das Metall und stellen Sie die Leistung so ein, dass die Abscheiderate für die Steuerung der Abscheidedicke geeignet ist.
- Öffnen Sie den Verschluss, um die Metallabscheidung zu starten. Schließen Sie den Verschluss, wenn die gewünschte Dicke erreicht ist.
- Wechseln Sie den Tiegel zwischen der sequentiellen Verdampfung von zwei Metallen.
- Warten Sie, bis die Tiegel abgekühlt sind, wie es das Gerät erfordert, entlüften Sie die Kammer und nehmen Sie die goldbeschichteten Glasobjektträger heraus.
- Pumpen Sie die Kammer für die Wartung der Ausrüstung wieder ab.
Anmerkung: Die Betriebsdetails können von einem bestimmten E-Beam-Verdampfer abhängen. Eine gut kontrollierte, niedrige Abscheiderate von Titan ist wichtig. Eine dicke Titanschicht führt oft zu schlechter Sicht, insbesondere bei der Fluoreszenzbildgebung der Zellen. Nach der Beschichtung können die titan/goldbeschichteten Objektträger in einer trockenen Vakuumkammer bei Raumtemperatur mindestens 1 Monat gelagert werden.
3. Mikrokontakt-Druck
- Schneiden Sie den titan/goldbeschichteten Objektträger in kleinere Stücke, falls gewünscht. Für eine typische Anwendung wird eine quadratische Form von 12 mm x 12 mm empfohlen (Abbildung 1B).
- Schiebe mit einem Glasschneider über die Oberfläche, um eine verbeulte Spur zu hinterlassen, halte dann den Glasschieber an beiden Seiten fest und biege ihn an der Delle, um in kleine Viertel zu brechen. Vermeiden Sie es, die mit Gold beschichtete Oberfläche zu berühren.
Anmerkung: Um visuell zu bestimmen, welche Seite des Glases im Falle eines versehentlichen Umkippens die beschichtete Oberfläche ist, vergleichen Sie die Lichtreflexion auf beiden Seiten. Die goldbeschichtete Oberfläche zeigt eine hellere Reflexion, während die unbeschichtete Seite eine schwächere Reflexion aufweist (von der Titanschicht auf der anderen Seite des Glases). Eine alternative Möglichkeit besteht darin, die Kanten des Schlittens zu beobachten, wobei die Beschichtungsseite aus der vertikalen Schnittfläche bestimmt werden kann.
- Reinigen Sie die Objektträger, indem Sie 100% Ethanol in einer Petrischale mit der Goldseite nach oben auf einem Orbitalschüttler für mindestens 10 Minuten einweichen. Saugen Sie das Ethanol ab und trocknen Sie dann jeden Objektträger durch Blasen mit einem Stickstoffstrahl.
- Reinigen Sie die PDMS-Stempel mit Seifenwasser und anschließend mit 100% Ethanol. Trockne die Stempel mit Stickstoffgas.
- Bereiten Sie 2 mM Octadecanthiol (C18) -Lösung her, indem 5,74 mg C18-Pulver in 10 ml 100%igem Ethanol gelöst werden.
Anmerkung: C18-Lösung verschließen und bei Raumtemperatur lagern. Beim Drucken von Modellen mit C18 entsteht eine selbstorganisierende Monoschicht, bei der sich das Fibronektin und die Zellen bevorzugt anlagern.
- Die PDMS-Stempel werden 10 s lang in C18-Lösung mit der gemusterten Oberfläche nach unten eingeweicht und 60 s lang sanft mit Stickstoffgas < /> getrocknet.
Anmerkung: Platzieren Sie den Strahl beim Trocknen zuerst vom Stempel weg (ca. 1 m), bis der größte Teil der Flüssigkeit verdunstet ist, und bewegen Sie dann den Strahl langsam näher, um den Stempel vollständig zu trocknen. Dadurch soll vermieden werden, dass die C18-Lösung weggeblasen wird, anstatt auf dem Stempel zu trocknen.
- Legen Sie den Stempel mit der bedruckten Seite nach unten 60 s auf die Golddias, bevor Sie ihn entfernen.
- Um das richtige Stempeln zu gewährleisten, klopfen Sie mit der Pinzette vorsichtig auf die Stempel, um die Muster richtig zu übertragen. Drücken Sie nicht zu stark nach unten, und das Gewicht der Pinzette ist in der Regel ausreichend.
Anmerkung: Durch die Sichtprüfung des Stempels während des Abstichs wird sichergestellt, dass der Stempel und der Objektträger gleichmäßig in Kontakt gekommen sind.
- Bereiten Sie Feuchtigkeitskammern vor.
- Pipettieren Sie 1 ml 70%iges Ethanol in einen umgedrehten Petrischalendeckel und legen Sie ein Stück Parafilm auf, um die Oberfläche zu bedecken (mit der Vorderseite nach oben).
- Verwenden Sie zum Anheben eine Pinzette, legen Sie den Parafilm auf, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen entstehen, und entfernen Sie bei Bedarf überschüssiges Ethanol
.
- 2 mM HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) Lösung herstellen: 5 μl Stammlösung in 5 mL 100 % Ethanol verdünnen.
Anmerkung: Die verdünnte EG3-Lösung kann verschlossen und bei 4 °C gelagert werden, und unverdünntes EG3-Material sollte bei -20 °C gelagert werden. Die EG3-Behandlung wird verwendet, um den Glasbereich ohne C18 nicht an Zellen haftend zu machen.
- Mikropipette 40 μl Tröpfchen EG3 für jeden Viertelglasobjektträger auf den Parafilm in der Feuchtigkeitskammer, wobei zwischen den Tröpfchen genügend Platz gelassen wird, um den Abstand der Goldobjektträger zu berücksichtigen.
- Platzieren Sie mit einer Pinzette mit C18-gedruckten Golddias mit der bedruckten Vorderseite nach unten auf die Tröpfchen und stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen unter den Objektträgern bilden. Schieben Sie die Objektträger vorsichtig zusammen, ohne sie anzuheben, um die Verdunstung zu minimieren.
Anmerkung: Platzieren Sie eine Kante des Glasschiebers in der Nähe des Tröpfchens nach unten und senken Sie dann das andere Ende des Glasschiebers langsam nach unten. Wenn eine Blase vorhanden ist, schieben Sie den Goldschieber, ohne ihn anzuheben, bis die Blase nicht mehr vorhanden ist.
- Verschließen Sie die Petrischale fest mit Parafilm und lassen Sie sie mindestens 3 h.
Anmerkung: Wenn eine ausgiebige Inkubation gewünscht ist, verschließen Sie die Petrischale doppelt und lassen Sie sie bis zu 24 Stunden stehen.
- Legen Sie die Goldobjektträger in eine Petrischale, legen Sie sie mit der Vorderseite nach oben in eine Petrischale, tränken und spülen Sie sie 3 Mal in 70%igem Ethanol, um EG3 zu entfernen, und lassen Sie sie dann 10 Minuten lang in Ethanol zur Sterilisation.
- Aspirieren Sie das Ethanol und ersetzen Sie es durch steriles PBS.
- Bereiten Sie eine weitere Feuchtigkeitskammer vor, wie in Schritt 3.9 beschrieben, mit PBS anstelle von Ethanol.
Anmerkung: Aufgrund des Unterschieds in der Oberflächenspannung ist es einfacher, zuerst 4-5 ml PBS hinzuzufügen, um Parafilm abzulegen und Blasen zu entfernen, und dann den Überschuss abzusaugen.
- Bereiten Sie die 50 μg/ml Fibronektinlösung (andere Proteine, falls gewünscht) in sterilem PBS vor und mikropipettieren Sie 50 μl Fibronektinlösung für jedes Viertel, schieben Sie es auf den Parafilm, wobei Sie etwas Abstand zwischen den Tröpfchen lassen.
Anmerkung: Die Fibronektinbeschichtung erleichtert die Zelladhäsion an strukturierten Oberflächen.
- Verwenden Sie eine Waferpinzette, um die Objektträger mit der Vorderseite nach unten auf die Tröpfchen zu legen und stellen Sie sicher, dass keine Blasen unter den Objektträgern entstehen. Schieben Sie die Rutschen vorsichtig zusammen, ohne sie anzuheben.
Anmerkung: Für die Handhabung der Objektträger empfiehlt sich eine Glasdiapinzette oder eine Waferpinzette mit geraden, breiten Spitzen.
- Lassen Sie die Petrischale 30 Minuten in der Biosicherheitswerkbank.
- Legen Sie nach 30 Minuten die Goldobjektträger mit der Vorderseite nach oben in PBS, nachdem Sie sie 3 Mal gespült haben.
Anmerkung: Objektträger mit Fibronektinmuster können in PBS bei 4 °C etwa einen Monat gelagert werden.
4. Zellen auf mikrostrukturierte Objektträger setzen
- Erwärmen Sie das Zellkulturmedium und das Trypsin in einem 37 °C heißen Wasserbad.
Anmerkung: Die folgende Beschreibung der Subkultur bezieht sich auf NIH/3T3-Zellen. Die Kulturbedingungen können je nach Zelltyp variieren.
- (Optional) Die gemusterten Objektträger in Nährmedien in einer 12-Well-Platte einweichen und vor der Trypsinisierung der Zellen in einem Inkubator auf 37 °C erwärmen, um eine bessere Zelladhäsion zu erzielen.
- Trypsinisieren Sie die Zellen, neutralisieren Sie sie mit FBS-haltigen Medien, zentrifugieren Sie sie 3 min lang bei 100 x g und resuspendieren Sie sie dann durch gutes Mischen mit frischen Medien.
Anmerkung: Achten Sie darauf, dass die Zellen vollständig voneinander dissoziiert sind.
- Zählen Sie die Zellen, verdünnen Sie sie auf 200.000 Zellen/ml und geben Sie 0,5 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung, die einen Goldobjektträger enthält.
- Schütteln Sie die Well-Platte einige Male vorsichtig, um eine gleichmäßige Zellaussaat zu gewährleisten, und lagern Sie sie 15 Minuten lang in einem Inkubator, um die Zellanhaftung zu ermöglichen.
- Überprüfen Sie nach 15 Minuten die Zellanhaftung unter einem Mikroskop. Planen Sie bei Bedarf zusätzliche Zeit ein.
Anmerkung: Die anhaftenden Zellen breiten sich mit sichtbarem Filopodium oder Abflachung auf der Oberfläche aus und bewegen sich nicht von der Oberfläche, wenn die Well-Platte vorsichtig angeklopft oder bewegt wird.
- Aspirieren Sie das Medium mit ungebundenen Zellen aus jeder Vertiefung und fügen Sie 1 ml Kulturmedium hinzu. Für die medikamentöse Behandlung ergänzen Sie die Nährmedien in diesem Schritt mit zusätzlichen Reagenzien.
- Kultivieren Sie die Zellen 24 h lang im Inkubator und überprüfen Sie die Konfluenz, um festzustellen, ob sich Chiralität gebildet hat.
Anmerkung: Für die meisten Zelltypen wird eine Konfluenz von über 75 % empfohlen, und eine Überkonfluenz kann die Chiralitätscharakterisierung beeinträchtigen.
5. Bildersammlung
- Fixieren Sie die Zellen bei Konfluenz.
- Nehmen Sie das Nährmedium aus der Well-Platte und spülen Sie es einmal mit PBS aus.
- 4% ige Paraformaldehydlösung zugeben, 15 min bei Raumtemperatur inkubieren und dann 3 Mal mit PBS spülen.
HINWEIS: Wenn die Fixierung die Zellmorphologie signifikant verändert, wird eine Bildgebung vor der Fixation empfohlen
- Verwenden Sie ein Phasenkontrastmikroskop mit Kamerafunktion, bilden Sie jeden Ring auf den Objektträgern mit hoher Auflösung ab (10-fach-Objektiv ist für die Analyse ausreichend).
>6. Charakterisierung der Zellchiralität (Abbildung 2)
- Laden Sie MATLAB-Codedateien für die Chiralitätscharakterisierung herunter.
- Fügen Sie den Codeordner und die Unterordner (mit der Circular Statistics Toolbox darin) zum MATLAB-Pfad hinzu und öffnen Sie die Datei "ROI_selection.m". Wechseln Sie in Zeile 4 das Verzeichnis in den gewünschten Datenordner (für Fensterbenutzer in den Zeilen 4 und 5 "/" in "\" umschalten).
- Ändern Sie die Bildgröße in Zeile 14, wobei die ersten beiden Ziffern die innere Kreisgröße des Rings darstellen, während die anderen beiden die äußere darstellen.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass die Größen aller Bilder in einem zu analysierenden Ordner identisch sind.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um den MATLAB-Code "ROI_selection.m" auszuführen und den Region of Interest (ROI) in Phasenkontrastbildern zu bestimmen.
- Ziehen Sie das Auswahlquadrat manuell an den Ring und doppelklicken Sie dann auf das Bild, um die Auswahl zu bestätigen.
- Wiederholen Sie diesen Schritt für jedes Bild im Ordner (das nächste Bild wird automatisch angezeigt, nachdem Sie die ROI-Auswahl eines vorherigen Bildes bestätigt haben); es wird eine ".mat"-Datei generiert, in der die ROI-Informationen für jedes Bild gespeichert werden.
- Öffnen Sie die Datei "Analysis_batch.m" und ändern Sie das Verzeichnis des Ordners wie in Schritt 6.2. (Für Windows-Benutzer, für die erstmalige Verwendung, schalten Sie "/" in den Zeilen 5, 6, 124 und 130 in "\" um)
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um den Code "Analysis_batch.m" auszuführen und die Chiralität mehrerer zellulärer Ringmuster zu bestimmen. Es wird eine "datatoexcel.txt"-Datei generiert, die zirkuläre Statistiken für jeden Ring sowie die Anzahl der im Uhrzeigersinn, nicht-chiralen und gegen den Uhrzeigersinn gerichteten Ringe enthält.
