Extrazellulärer Vesikelaufnahme-Assay: Eine Methode zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Aufnahme von extrazellulären Vesikeln mit Hilfe der 3D-Fluoreszenzbildgebungstechnik

Abstract

Quelle: Kim, C. J., et al., Extrazellulärer Vesikelaufnahme-Assay mittels konfokalmikroskopischer bildgebender Analyse. J. Vis. (2022).

In diesem Video demonstrieren wir einen Assay zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Aufnahme von extrazellulären Vesikeln oder EVs. Dieser Assay nutzt 3D-Fluoreszenzbildgebung mit einem konfokalen Mikroskop und ermöglicht die Unterscheidung von internalisierten EVs von solchen, die an der Zelloberfläche haften.

Protocol

1. EV-Isolierung und On-Chip-Immunfluoreszenz-EV-Markierung

1. Entnahme von Zellkulturmedien (CCM) und Vorverarbeitung von CCM für die EV-Isolierung
   1. PC3-Zellen mit 30 % Konfluenz in einem 75 cm 2-Zell-Kulturkolben aussäen. Lassen Sie die Kontrollzellen auf 90 % Konfluenz (~48 h) in Standardmedien und zelllinienspezifischen Ergänzungen wachsen.
      Anmerkung: Um zu verhindern, dass EV-haltige Komponenten die zelluläre Aufnahme beeinflussen (z. B. fötales Rinderserum), verwenden Sie Exosomen-abgereicherte Medien und Nahrungsergänzungsmittel.
   2. Ernte den CCM.
   3. Zentrifugieren Sie das CCM bei 1000 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT), um alle nicht gebundenen Zellen und großen Ablagerungen, die mit dem Medium geerntet wurden, zu pelletieren. Den Überstand in ein neues konisches Röhrchen umfüllen.
   4. Im neuen Röhrchen wird der Überstand bei 10.000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert, um kleinere Ablagerungen und apoptotische Körper, die im Medium verbleiben, zu pelletieren. Einige größere Elektrofahrzeuge werden pelletieren. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen.
   5. Filtrieren Sie den Überstand durch einen hydrophilen 0,45-μm-Membranspritzenfilter aus Polyvinylidenfluorid (PVDF).
      Anmerkung: Wenn CCM nicht sofort für die EV-Isolierung verarbeitet wird, lagern Sie das vorverarbeitete CCM bei -80 °C, bis die Isolierung durchgeführt wird. Wenn es eingefroren ist, begrenzen Sie die Gefrier-Tau-Zyklen auf einen.
2. EV-Isolierung von CCM mit einem auf Nanofiltration basierenden mikrofluidischen Gerät
   1. Wenn es eingefroren ist, tauen Sie CCM und Vortex vor Schritt 1.2.2 30 s lang vollständig auf.
   2. Injizieren Sie 1 ml vorverarbeitetes CCM (Schritt 1.1) in die Probenkammer des auf Nanofiltration basierenden mikrofluidischen Geräts (siehe Materialtabelle).
      Anmerkung: Befolgen Sie die Standardarbeitsanweisung für das auf Nanofiltration basierende mikrofluidische Gerät.
   3. Schleudern Sie 10 Minuten lang mit 3000 U/min in der Tischspinnmaschine (siehe Materialtabelle), um das mikrofluidische Gerät zu betreiben.
      Anmerkung: Wenn CCM nach dem ersten Lauf in der Probenkammer verbleibt, führen Sie weitere Drehungen durch, bis sich alle CCM aus der Probenkammer entleert haben.
   4. Entfernen Sie die Flüssigkeit durch Pipettieren aus der Abfallkammer und wiederholen Sie die Schritte 1.2.1, 1.2.2 und 1.2.3 zweimal.
      Anmerkung: Insgesamt werden 3 mL CCM für die EV-Isolierung verarbeitet.
   5. Injizieren Sie 1 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Probenkammer, um die isolierten EVs zu waschen. Schleudern Sie die Tischspinnmaschine für den Betrieb des mikrofluidischen Geräts, wie in Schritt 1.2.3 beschrieben. Lokalisieren Sie die reinen EVs auf der Membran des Geräts.
      Anmerkung: Die Qualität von EVs, die aus dem auf Nanofiltration basierenden mikrofluidischen Gerät isoliert wurden, wurde in der vorangegangenen Forschung durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Rasterelektronenmikroskop (REM), Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), strukturierte Beleuchtungsmikroskopie, enzymgebundenen Immunsorbent-Assay und Echtzeit-PCR bestätigt und mit der herkömmlichen UC-Methode verglichen.
3. Immunfluoreszenzmarkierung von EV mit Hilfe eines mikrofluidischen Geräts auf Nanofiltrationsbasis (Abbildung 1)
   1. Wählen Sie einen EV-spezifischen Antikörper entsprechend dem Zweck des Assays aus (siehe Materialtabelle).
      Anmerkung: Bestimmte Antikörper können Ligandenbindungsstellen stören, die für EV-Aufnahmewege (z. B. Endozytose) spezifisch sind.
   2. Injizieren Sie 1 μg/ml des EV-spezifischen Antikörpers in das Elutionsloch des Geräts, das 100 μl isolierte EVs enthält.
   3. Inkubieren Sie 1 h lang im Dunkeln bei RT auf einem Plattenschüttler, um eine gleichmäßige Verteilung des Antikörpers in der Probe zu gewährleisten.
   4. Befestigen Sie ein Klebeband an der Elutionsöffnung. Injizieren Sie 1 ml PBS in die Probenkammer, um alle verbleibenden Antikörper auszuwaschen.
   5. Drehen Sie das Gerät mit 3000 U/min, bis die Probenkammer leer ist. Entfernen Sie jegliche Flüssigkeit durch Pipettieren aus der Abfallkammer. Injizieren Sie 1 ml PBS in die Probenkammer.
      Anmerkung: Fluoreszenzmarkierte EVs werden sich in der Membrankammer befinden.
   6. Pipettieren Sie die fluoreszenzmarkierten EVs (Abbildung 2) aus der Membrankammer in ein braunes Röhrchen. Bis zum Gebrauch vor Licht schützen.

2. Inkubation der Zellen mit fluoreszenzmarkierten EVs für den EV-Aufnahmeassay

1. Gezielte Zellaussaat und -kultur auf den zellkulturkompatiblen Schalen.
   1. 1 x 10⁴ PC3-Zellen mit 0,2 mL Medium in die 8-Well-Platte des Microslide (9,4 x 10,7 mm für jede Well) oder 4 x 10⁴ PC3-Zellen in eine 35-mm-Schale mit 1 mL Medium aussäen. Füllen Sie die Zellen in eine zellkulturkompatible Schale, die aus einem dünnen Deckglas (Dicke: 0,18 mm) besteht.
      Anmerkung: Das dünne Deckglas minimiert die nachteilige Streuung des Lichts.
   2. Lassen Sie die Zellen über Nacht unter optimalen Zellkulturbedingungen (37 °C, 5 % CO₂ -Konzentration, 90 % Luftfeuchtigkeit) haften.
   3. Die adhärenten Zellen werden zweimal mit Exosomen-depletierten Medien gewaschen (beschrieben in Schritt 1.1.1).
2. Zellinkubation mit fluoreszenzmarkierten EVs.
   1. Messung der Konzentration von fluoreszenzmarkierten EVs (Schritt 1.3.5) mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA, Abbildung 3). Bestimmung der optimalen Konzentration von fluoreszenzmarkierten EVs, die den kultivierten Zellen zugesetzt werden sollen (Schritt 2.1.2.).
   2. Die fluoreszenzmarkierten EVs werden mit Exosomen-abgereichertem Medium verdünnt, um die gewünschte Konzentration zu erreichen, die in Schritt 2.2.1 gemessen wurde. (d. h. 7,80 x 10⁹ EVs (im NTA-Wert) in 200 μl Exosomen-abgereicherten Medien.)
   3. Die verdünnten EV (Schritt 2.2.2) werden zu den in Nummer 2.1.2 hergestellten adhärenten Zielzellen gegeben. Inkubieren Sie für eine experimentelle Zeit (d. h. 4, 8 oder 12 Stunden).
   4. Waschen Sie die Zellen dreimal mit exosomenfreien Medien, um nicht internalisierte EVs zu entfernen.
      Anmerkung: Optional: Zellen können nach dem Waschen fixiert werden.
   5. Das Zytoplasma der adhärenten Zellen wird mit 1 μg/ml CMTMR ((5-(und-6)-(((4-chlormethyl)benzoyl)amino)-tetramethylrhodamin) markiert (siehe Materialtabelle) und unter optimalen Zellkulturbedingungen (37 °C, 5 % CO₂ -Konzentration, 90 % Luftfeuchtigkeit) inkubiert.
      Anmerkung: Zellflächenfarbstoffe sollten getrennt von markierten EVs fluoreszieren, um die Bestimmung der räumlichen Position (internalisiert oder oberflächlich) der gespickten EVs während des EV-Aufnahmeassays zu erleichtern.
   6. Waschen Sie markierte Zellen zweimal mit Exosomen-abgereicherten Medien, um den restlichen Farbstoff zu entfernen. Geben Sie den Zellen frisches, mit Exosomen abgereichertes Medium zu, um die konfokale Bildgebung mit lebenden Zellen vorzubereiten.

3. Konfokale Mikroskopie

1. Verwenden Sie für die Bildgebung lebender Zellen einen Inkubator auf dem Tisch, um optimale Zellkulturbedingungen (37 °C, 5 % CO_{2 -}Konzentration, 90 % Luftfeuchtigkeit) aufrechtzuerhalten.
2. Legen Sie die vorbereiteten Zellen in den Inkubator auf der Bühne.
3. Stellen Sie die Bildgebungsparameter basierend auf Kontrollproben ein.
   Anmerkung: Zu den empfohlenen Kontrollproben gehören: Nur fluoreszenzmarkierte EVs, fluoreszenzmarkierte Zellen, unmarkierte EVs und unmarkierte Zellen.
4. Bestimmen Sie die Tiefe der Zielzellen und den Bereich der Stapelgröße in z-Richtung, um konfokale 3D-Bilder aufzunehmen.
   Anmerkung: Die Dicke eines Z-Stapels beträgt 1 μm. Die konfokale 3D-Bildaufnahme dauerte 2 min 34 s (jede Z-Ebenen-Aufnahme dauerte ca. 8 s; insgesamt zwanzig Z-Stack-Bilder).
5. Stellen Sie die Bildaufnahme auf mehrere z-gestapelte Bilder von zellspezifischem Farbstoff (d. h. rot) und EV-spezifischem Farbstoff (d. h. grün) gleichzeitig ein (Abbildung 4 und Abbildung 5A).

4. Bildverarbeitung

1. Verwenden Sie eine automatische Bildverarbeitungssoftware, um die konfokalen Rohbilder mit Z-Stapeln zu analysieren und die EV-Aufnahme durch Zellen zu bestimmen (siehe Materialtabelle).
2. Legen Sie die Schwellenwertparameter für das Fluoreszenzsignal der Zellen und EV-spezifische Farbstoffe fest. Erstellen Sie die virtuellen Oberflächen von Zellen (Abbildung 5A,B).
   1. Um die virtuellen Flächen von Zellen zu erstellen, klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Flächen hinzufügen.
   2. Wählen Sie Berechnung der kürzesten Entfernung als "Algorithmuseinstellungen", um den von der Software bereitgestellten Algorithmus zu verwenden, und klicken Sie dann auf Weiter: Quellkanal.
   3. Wählen Sie in diesem Experiment Kanal 2 – CMTMR als "Quellkanal" aus.
   4. Wählen Sie Glätten und geben Sie den entsprechenden Wert in "Oberflächendetails" ein, um die Oberfläche zu glätten.
      HINWEIS: 0,57 μm in diesem Experiment, da 1 Pixel 0,57 μm in den Rohdaten der Bildgebung entspricht.
   5. Wählen Sie "Absolute Intensität" als "Schwellenwert" aus.
   6. Um den Schwellenwert für das Fluoreszenzbild mit dem bereitgestellten Algorithmus automatisch zu erhöhen, klicken Sie auf Schwellenwert (absolute Intensität): Der Wert wird automatisch festgelegt.
   7. Wählen Sie Aktivieren als "Berührende Objekte teilen (Region wachsend)" und geben Sie den Wert der geschätzten Zellgröße in diesem Experiment in "Kernpunktdurchmesser" von 10,0 μm ein. Klicken Sie dann auf Weiter: Seed-Punkte filtern.
   8. Um die virtuellen Zelloberflächen zu konfigurieren, klicken Sie auf die Schaltfläche + Hinzufügen und wählen Sie dann Qualität als "Filtertyp" aus. Legen Sie den entsprechenden Wert (210 in diesem Experiment) für die untere Grenze durch eine visuelle Inspektion und den Maximalwert (1485) für die obere Grenze fest und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Fertig stellen.
      Anmerkung: Eine visuelle Inspektion bedeutet, dass ein Forscher den zellulären Bereich von einem fluoreszierenden Rohbild unterscheiden kann.
   9. Um als Nächstes die virtuellen Punkte von Elektrofahrzeugen zu erstellen, klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Spots hinzufügen.
   10. Wählen Sie "Unterschiedliche Spot-Größen (Region Growing") und "Berechnung der kürzesten Entfernung" als "Algorithmus-Einstellungen" aus und klicken Sie dann auf "Weiter: Quellkanal".
   11. Wählen Sie in diesem Experiment Kanal 1 - Alexa Fluor 488 als "Quellkanal" aus.
   12. Geben Sie den entsprechenden Wert in "Geschätzter XY-Durchmesser" für die Spot-Detektion ein, 1 μm in diesem Experiment. Klicken Sie dann auf Weiter: Spots filtern.
   13. Um die virtuellen EV-Punkte zu konfigurieren, klicken Sie auf die Schaltfläche + Hinzufügen, wählen Sie Qualität als "Filtertyp" und stellen Sie den "unteren Schwellenwert" durch eine visuelle Inspektion ein, 100 in diesem Experiment. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Weiter: Bereichsbereichstyp.
   14. Wählen Sie "Absolute Intensität" als "Typ für Spot-Bereiche" aus und klicken Sie dann auf "Weiter: Spot-Bereiche".
   15. Um den Schwellenwert, den Bereich der EV-Punkte, zu bestimmen, geben Sie den entsprechenden Wert durch eine visuelle Inspektion in "Bereichsschwellenwert" ein, 100 als "Bereichsschwellenwert" in diesem Experiment.
       Anmerkung: Eine visuelle Inspektion bedeutet, dass ein Forscher den Bereich des Elektrofahrzeugs von einem fluoreszierenden Rohbild unterscheiden kann.
   16. Wählen Sie "Bereichsvolumen" als "Durchmesser ab" aus und klicken Sie dann auf "Fertig stellen".
3. Verwenden Sie die von der Software bereitgestellten Algorithmen, um die gruppierten Punkte innerhalb der gebauten Oberfläche in Schritt 4.2 zu teilen (Abbildung 5C, i-iv).
   1. Klicken Sie auf die erstellten Spots und gehen Sie dann zu Filter.
   2. Klicken Sie auf die Schaltfläche + Hinzufügen, wählen Sie dann Kürzeste Entfernung zu Oberflächenoberflächen = Oberfläche 1 als Filtertyp aus und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Auswahl auf neue Punkte duplizieren. Der unterste Schwellenwert (-7,0 in diesem Experiment) für die untere Grenze und der entsprechende Wert (-0,5) für die obere Grenze.
      Anmerkung: Legen Sie die Obergrenze mit dem geschätzten Radius der Punkte fest. In diesem Experiment wurde der geschätzte Durchmesser von Spots, d.h. EV-Punkten, in Schritt 4.2.11 auf 1 μm festgelegt; Die Obergrenze kann also bei 0,5 liegen.
4. Automatische Zählung der Elektrofahrzeuge in den Zellen
   Anmerkung: Die Software zählt automatisch die Anzahl der EVs in den Zellen und zeigt die Anzahl an, die von den Zielzellen verinnerlicht wird.
   1. Klicken Sie auf die erstellte Auswahl Spots 1 [Kürzeste Entfernung zu Flächenflächen = Flächen 1 zwischen -7,00 und -0,500].
   2. Gehen Sie zu den Statistiken und exportieren Sie den Wert aus "Gesamtzahl der Spots"
      Anmerkung: Die von der Software bereitgestellten Algorithmen berechnen automatisch die Anzahl und das Volumen der Zellen.
5. Bestimmen Sie die Ausbeute der EV-Aufnahme pro Inkubationszeit auf der Grundlage der oben berechneten Werte (Abbildung 6).
   1. Um die Anzahl der Zellen zu erhalten, klicken Sie auf die erstellten Flächen 1, gehen Sie dann zu den Statistiken und exportieren Sie den Wert von "Gesamtzahl der Flächen" aus Gesamt.
   2. Gehen Sie zu Detailliert in Statistik, um das Volumen aus Detailed zu exportieren.

Results

Abbildung 1: Schematische Darstellung der EV-Isolierung und der On-Chip-Markierung mit einem auf Nanofiltration basierenden mikrofluidischen Gerät. (A) Isolierung von EVs von CCM. (B) On-Chip-Immunfluoreszenzmarkierung von Elektrofahrzeugen. (C) Entfernung von ungebundenen Antikörpern.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 Anti-Human-CD63 Antikörper	Biolegende	353038	Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter EV-spezifischer Antikörper
CellTracker Orange CMTMR Farbstoff	Thermo Fisher Scientific	Nr. C2927	Reagenz zur Fluoreszenzmarkierung von lebenden Zellen (Zytoplasma)
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Nikon	MRD77400	Objektiv für konfokale Bildgebung, NA=1,25
CFI Plan Apo VC 20X	Nikon	MRD70200	Objektiv für konfokale Bildgebung, NA=0,75
Exodisc	Labspinner Inc.	EX-D1001	Ein auf Nanofiltration basierendes mikrofluidisches Gerät zur Isolierung von Elektrofahrzeugen
ExoDiscovery (Englisch)	Labspinner Inc.	EX-R1001	Bediengerät für Exodisc
Exosom-depletiertes FBS	Thermo Fisher Scientific	A2720801	Nährstoff von Zellkulturmedien für die Sammlung von aus PC3-Zelllinien gewonnenen EV
Fötales Rinderserum (FBS)	VWR	1500-500	Nährstoff für die Zellkultivierung
Ziege Anti-Maus IgG H&L voradsorbiert	ABCAM	AB7063	Maus-IgG-Antikörper zur negativen Kontrolle der EV-Markierung
Ibidi USA U DISH μ-Schale 35 mm	Ebd.	Artikel-Nr.: 81156	Kulturschale für die konfokale Bildgebung
Imaris 9.7.1	Oxford Instrumente	9.7.1	Software für die Bildverarbeitung
Inkubator-System+ CO2/O2/N2-Gasmischer	Instrument für lebende Zellen	TU-O-20	Inkubatorsystem für die Bildgebung lebender Zellen
Nikon A1 HD25 / A1R HD25 Kamera	Nikon	Na	Kamera für konfokale Bildgebung
Nikon Eclipse Ti Mikroskop	Nikon	Na	Inverses Mikroskop für konfokale Bildgebung
NIS-Elemente AR 4.50.00	Nikon	4.50,00	Bildverarbeitungssoftware für Nikon-Mikroskope
NTA, NanoSight NS500	Malvern Panalytical	NS500	Messgerät für die EV-Konzentration
OriginPro 2020	OriginLab	9.7.0.185	Software für die grafische Darstellung
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotika für die Zellkultivierung
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	21875034	Zellkulturmedien für die Kultivierung von PC3-Zelllinien
SYTO RNASelect Grün fluoreszierender Zellfleck - 5 mM Lösung in DMSO	Thermo Fisher Scientific	Nr. S32703	RNA-Färbe-Fluoreszenzfarbstoff für die EV-Markierung