Extrazellulärer Vesikelaufnahme-Assay: Eine Methode zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Aufnahme von extrazellulären Vesikeln mit Hilfe der 3D-Fluoreszenzbildgebungstechnik

Abstract

Quelle: Kim, C. J., et al., Extrazellulärer Vesikelaufnahme-Assay mittels konfokalmikroskopischer bildgebender Analyse. J. Vis. (2022).

In diesem Video demonstrieren wir einen Assay zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Aufnahme von extrazellulären Vesikeln oder EVs. Dieser Assay nutzt 3D-Fluoreszenzbildgebung mit einem konfokalen Mikroskop und ermöglicht die Unterscheidung von internalisierten EVs von solchen, die an der Zelloberfläche haften.

Protocol

1. EV-Isolierung und On-Chip-Immunfluoreszenz-EV-Markierung

1. Entnahme von Zellkulturmedien (CCM) und Vorverarbeitung von CCM für die EV-Isolierung
   1. PC3-Zellen mit 30 % Konfluenz in einem 75 cm 2-Zell-Kulturkolben aussäen. Lassen Sie die Kontrollzellen auf 90 % Konfluenz (~48 h) in Standardmedien und zelllinienspezifischen Ergänzungen wachsen.
      Anmerkung: Um zu verhindern, dass EV-haltige Komponenten die zelluläre Aufnahme beeinflussen (z. B. fötales Rinderserum), verwenden Sie Exosomen-abgereicherte Medien und Nahrungsergänzungsmittel.
   2. Ernte den CCM.
   3. Zentrifugieren Sie das CCM bei 1000 x

Results

Abbildung 1: Schematische Darstellung der EV-Isolierung und der On-Chip-Markierung mit einem auf Nanofiltration basierenden mikrofluidischen Gerät. (A) Isolierung von EVs von CCM. (B) On-Chip-Immunfluoreszenzmarkierung von Elektrofahrzeugen. (C) Entfernung von ungebundenen Antikörpern.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 Anti-Human-CD63 Antikörper	Biolegende	353038	Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter EV-spezifischer Antikörper
CellTracker Orange CMTMR Farbstoff	Thermo Fisher Scientific	Nr. C2927	Reagenz zur Fluoreszenzmarkierung von lebenden Zellen (Zytoplasma)
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Nikon	MRD77400	Objektiv für konfokale Bildgebung, NA=1,25
CFI Plan Apo VC 20X	Nikon	MRD70200	Objektiv für konfokale Bildgebung, NA=0,75
Exodisc	Labspinner Inc.	EX-D1001	Ein auf Nanofiltration basierendes mikrofluidisches Gerät zur Isolierung von Elektrofahrzeugen
ExoDiscovery (Englisch)	Labspinner Inc.	EX-R1001	Bediengerät für Exodisc
Exosom-depletiertes FBS	Thermo Fisher Scientific	A2720801	Nährstoff von Zellkulturmedien für die Sammlung von aus PC3-Zelllinien gewonnenen EV
Fötales Rinderserum (FBS)	VWR	1500-500	Nährstoff für die Zellkultivierung
Ziege Anti-Maus IgG H&L voradsorbiert	ABCAM	AB7063	Maus-IgG-Antikörper zur negativen Kontrolle der EV-Markierung
Ibidi USA U DISH μ-Schale 35 mm	Ebd.	Artikel-Nr.: 81156	Kulturschale für die konfokale Bildgebung
Imaris 9.7.1	Oxford Instrumente	9.7.1	Software für die Bildverarbeitung
Inkubator-System+ CO2/O2/N2-Gasmischer	Instrument für lebende Zellen	TU-O-20	Inkubatorsystem für die Bildgebung lebender Zellen
Nikon A1 HD25 / A1R HD25 Kamera	Nikon	Na	Kamera für konfokale Bildgebung
Nikon Eclipse Ti Mikroskop	Nikon	Na	Inverses Mikroskop für konfokale Bildgebung
NIS-Elemente AR 4.50.00	Nikon	4.50,00	Bildverarbeitungssoftware für Nikon-Mikroskope
NTA, NanoSight NS500	Malvern Panalytical	NS500	Messgerät für die EV-Konzentration
OriginPro 2020	OriginLab	9.7.0.185	Software für die grafische Darstellung
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotika für die Zellkultivierung
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	21875034	Zellkulturmedien für die Kultivierung von PC3-Zelllinien
SYTO RNASelect Grün fluoreszierender Zellfleck - 5 mM Lösung in DMSO	Thermo Fisher Scientific	Nr. S32703	RNA-Färbe-Fluoreszenzfarbstoff für die EV-Markierung