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1. Neues Kammerdesign (Abbildung 1)
- Öffnen Sie eine neue Zweikammer-Zellanalysatorplatte. Legen Sie die obere Kammer mit den Elektroden beiseite.
- Rasieren Sie mit einer Fräse 2 mm der U-förmigen Bodenvertiefungen der Zellanalysatorplatte ab.
- Befestigen Sie eine 2 cm x 7 cm große Polyethersulfon (PES)-Membran mit einer Porengröße von 0,2 μm mit UV-gehärtetem Klebstoff am Boden der rasierten Vertiefungen. Warten Sie 30 Minuten Kurationszeit, um sicherzustellen, dass der Kleber vollständig ausgehärtet und inert ist.
- Schneiden Sie mit einer Fräse zwei Längsschlitze (1,5 mm x 5,6 mm) an den Seiten aus, die in die Rillen der neu gefertigten dritten Kammer einrasten.
- Erstellen Sie mit einer Fräsmaschine eine dritte Polycarbonat-Kammer, die die Gesamtabmessungen der Zellanalysatorplatte nachbildet; 72 mm x 18 mm (Materialtabelle).
- Erstellen Sie Wells mit einer Tiefe von 4,8 mm und einem Durchmesser von 4,75 mm, um das 16-Well-Design der Zellanalysatorplatte zu replizieren. Dies ermöglicht ein Volumen von 90 μl pro Well.
- An den Seiten zwei dreieckige Rillen bilden, so dass die Kammer in die ursprünglichen Schlitze einrastet, die in Schritt 1.4 entstanden sind. Der horizontale Teil des Dreiecks beträgt 1,5 mm, der vertikale 1,4 mm und die Hypotenuse 2,052 mm.
- Erstellen Sie an der kurzen Seite einen Knopf mit einem Durchmesser von 50,8 mm und einer Höhe von 1,397 mm, der in die Kerbe der Originalplatte passt (Abbildung 1, Mitte).
- Verwenden Sie für jede Vertiefung eine 0,9 mm dicke Gummischeibe, um eine dichte Passform zu gewährleisten.
2. Zellkultur (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-Fibroblasten)
- Adhärente Zellkulturen (~70% Konfluenz) mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen.
- Fügen Sie 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, um die Zellen abzuheben.
- Die Trypsinlösung wird mit einem serumhaltigen Zellkulturmedium neutralisiert und die Zellen mit einem Aliquot der Zellsuspension gezählt.
Anmerkung: Die spezifischen Zellkulturmedien sind in Tabelle 1 zu finden.
3. Vom Patienten stammende Xenotransplantat-Dissoziation
- Ein frisches Tumorstück (1 cm2) mit einem sterilen Skalpell in feinen Brei schneiden.
- In ein konisches 50-ml-Röhrchen 20 ml DMEM F12-Medium geben, ergänzt mit 3 mg/ml Trypsin und 2 mg/ml Kollagenase.
- Inkubieren Sie in einem Thermoschüttler (150 U/min) bei 37 °C für 20 Minuten.
- Das Röhrchen bei 500 x g 5 min drehen, den Überstand entfernen.
- Fügen Sie 20 μl DMEM F12 + 2 % FBS hinzu, um die Zellen zu waschen, schleudern Sie 5 Minuten lang bei 300 x g und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den Waschgang noch zwei Mal.
- Resuspendieren Sie in 1 ml PDX-Medium (Tabelle 1), um die Zellen zu zählen.
4. Entnahme von Knochenmarkzellen
- Spülen Sie den Auffangfilter des Knochenmarks (BM) mit 25 mL 1x PBS.
Anmerkung: In dieser Studie wurde PBS zu einem gebrauchten BM-Sammelfilter aus dem Krankenhaus hinzugefügt, um das verbleibende BM im Filter zu sammeln.
- Geben Sie das gespülte BM langsam in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 25 mL Dichtegradientenmedium und achten Sie darauf, die Schichten so weit wie möglich voneinander getrennt zu halten.
- Bei 800 x g für 20 min bei 18 °C schleudern.
- Saugen Sie die oberen Schichten nach der Zentrifugation ab (Fett/Plasma) und übertragen Sie 5 mL der weißen Schicht über dem Dichtegradientenmedium, das die BM-Zellen enthält, in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
Anmerkung: Alternativ können Sie eine 5-ml-Pipette in die oberste Schicht tauchen, bis sie die mittlere Schicht (BM) berührt, und die mittlere Schicht sehr langsam herauspipettieren, ohne die Pipette zu bewegen.
- Füllen Sie das konische 15 mL Röhrchen mit 1x PBS (~10 mL) und schleudern Sie bei 300 x g für 15 min.
- Entfernen Sie den Überstand; das verbleibende weiße Kügelchen ist das BM.
- Wenn rote Blutkörperchen im Pellet beobachtet werden, fügen Sie 5 ml Erythrozyten-Lyselösung hinzu (Tabelle der Materialien) und lassen Sie sie 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT) einwirken. Bei 300 x g 5 min schleudern und den Überstand entfernen.
- Fügen Sie 10 mL 1x PBS hinzu, um die Zellen zu waschen, schleudern Sie 5 Minuten lang bei 300 x g und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Erythrozytenlyse (Schritt 4.7), bis das Pellet weiß ist.
5. Zell-Seeding und Assemblierung
- Platzieren Sie alle drei sterilen Kammern in der Gewebekulturhaube.
- Platzieren Sie den Knopf an der kurzen Seite der unteren Kammer. Richten Sie die untere Kammer so aus, dass der Knopf dem Experimentator zugewandt ist.
- Geben Sie 30.000-50.000 Zellen in 90 μl Medium in jede Vertiefung der unteren Kammer. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Dies sind die Stromazellen, die sezernierte Faktoren liefern, aber von den Elektroden der oberen Kammer nicht erkannt werden.
- Verwenden Sie 5 % mit fötalem Rinderserum supplementiertes Medium in zwei Vertiefungen der unteren Kammer als Positivkontrolle für die Zellmotilität. Verwenden Sie 0 % Serum-supplementierte Medien als Negativkontrolle.
- Lassen Sie die untere Kammer mit den Zellen 10-15 Minuten in der Haube ruhen, um sich abzusetzen.
Anmerkung: Dieser Schritt wird empfohlen, wenn Zellen adhärent sind oder in Suspension wachsen.
- Drehen Sie die untere Kammer um 90° und legen Sie die mittlere Kammer darauf, so dass der Knopf an der unteren Kammer in die Kerbe an der mittleren Kammer gleitet.
Anmerkung: Der Knopf an der unteren Kammer und der blaue Punkt an der mittleren Kammer befinden sich an gegenüberliegenden Enden der Baugruppe.
- Drücken Sie vertikal nach unten, bis von jeder der Längsseiten der Baugruppe ein Klickgeräusch zu hören ist.
- Geben Sie 160 μl serumfreies Medium in alle Vertiefungen der mittleren Kammer.
- Stellen Sie sicher, dass ein kuppelförmiger Meniskus sichtbar ist, nachdem die Vertiefungen gefüllt wurden. Andernfalls passen Sie das endgültige Volumen basierend auf der Pipettenkalibrierung an. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.
- Platzieren Sie die obere Kammer mit den Elektroden nach unten auf der mittleren Kammer und achten Sie darauf, dass die blauen Punkte in der mittleren und oberen Kammer ausgerichtet sind.
- Drücken Sie vertikal nach unten, bis von jeder der Längsseiten der Baugruppe ein Klickgeräusch zu hören ist.
- Geben Sie 25-50 μl serumfreies Medium in die obere Kammer.
- Montieren Sie die Baugruppe auf dem Dual-Purpose-Zellanalysator im Gewebekultur-Inkubator und warten Sie 30 Minuten, bevor Sie den Hintergrund messen.
Anmerkung: Diese Zeit ist notwendig, um das Array auszugleichen, und kann zur Vorbereitung der Zelllinien verwendet werden, die in die obere Kammer hinzugefügt werden sollen.
- Messen Sie den Hintergrund (siehe Abschnitt 6) und setzen Sie die Baugruppe wieder in die Gewebekulturhaube ein.
- Geben Sie 30.000 bis 50.000 Zellen in 100 μl serumfreiem Medium in jede Vertiefung der oberen Kammer. Dies sind die Zellen, die die Elektrode erkennt, sobald sie erfolgreich durch die Membran gewandert sind
Anmerkung: Um ein maximales Ansprechen zu erzielen, wird empfohlen, die Zellen vor der Durchführung des Assays 6-18 Stunden lang in serumfreien Medien oder Medien mit niedrigem Serumgehalt zu züchten.
- Lassen Sie die Baugruppe 30 Minuten in der Haube stehen, bevor Sie sie zur Impedanzmessung auf den Dual-Purpose-Zellanalysator montieren.
6. Hintergrund- und Impedanzmessung
- Setzen Sie das Array in die Halterung des Mehrzweck-Zellanalysators ein.
- Öffnen Sie die Zellanalysator-Software und wählen Sie die zu verwendende Dockingstation aus.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Nachricht und stellen Sie sicher, dass Verbindungen OK angezeigt wird, um sicherzustellen, dass das Array gut in der Dockingstation platziert ist und die Elektroden gut mit den Sensoren ausgerichtet sind.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Experimentnotizen und geben Sie so viele Informationen wie möglich über das Experiment ein.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Layout und geben Sie die Beschreibung des Array-Layouts ein.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Zeitplan und fügen Sie zwei Schritte aus dem Menü Schritte hinzu: einen Hintergrundschritt (ein Sweep) und einen Testschritt mit 100 Sweeps - einen Sweep alle 15 Minuten, insgesamt 25 Stunden.
- Nachdem sich das Array 30 Minuten lang im Inkubator des Dual-Purpose-Zellanalysators befunden hat, klicken Sie auf die Schaltfläche Play, um die Hintergrundmessung zu starten. Es öffnet sich ein Fenster, in dem Sie aufgefordert werden, den Ordner zum Speichern der Daten auszuwählen.
- Nachdem die Hintergrundmessung abgeschlossen ist, nehmen Sie das Array aus der Halterung und setzen Sie es wieder in die Zellkulturhaube ein.
- Geben Sie die Zellen in die obere Kammer, wie in Schritt 5.13 beschrieben, und halten Sie die Anordnung 30 Minuten lang in der Gewebekulturhaube, damit sich die Zellen absetzen können.
- Platzieren Sie das Array wieder in den Dual-Purpose-Zellanalysator und suchen Sie auf der Registerkarte Nachricht nach der Meldung Verbindungen OK.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Play, um die Impedanzmessung zu starten.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Plot, um den Fortschritt des Signals zu überwachen.
- Wenn der Endpunkt vor 25 Uhr erreicht ist, klicken Sie im Dropdown-Menü Ausführen auf den Schritt Abbrechen.
- Um Daten zu exportieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm, wählen Sie Kopieren im Listenformat und fügen Sie die Daten dann in eine Tabelle ein.
Anmerkung: Die Daten können als Zellindex oder Delta-Zellindex exportiert werden. Diagramm- und/oder Layoutinformationen können ebenfalls für den Export ausgewählt werden.
Tabelle 1: Zusammensetzung der Zellkulturmedien. In der Tabelle sind die Zusammensetzungen von MDA-MD-231-Medien, J2-Fibroblastenmedien, DCIS-Medien und PDX-Medien aufgeführt.
| Medien | Bestandteile | Konzentration/Anteil |
| MDA-MD-231 Medien | DMEM | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | 10 % |
| J2 Fibroblasten Medien | DMEM | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | 10 % |
| DCIS-Medien | DMEM F12 | |
| Pferdeserum (HS) | 5 % |
| Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) | 20 ng/ml |
| Insulin | 10 μg/ml |
| Hydrocortison | 0,5 μg/ml |
| Cholera-Toxin | 100 ng/ml |
| PDX-Medien | DMEM F12 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | 2 % |
| HEPES | 1 Mio. |
| Insulintransferrin Selenethanolamin (ITS) | 10 μg/ml |
| Hydrocortison | 0,5 μg/ml |
| Rinderserumalbumin (BSA) | 1 mg/ml |
