Citratsynthase-Aktivitätsassay: Ein kolorimetrischer Assay zur Messung der mitochondrialen Citratsynthase-Aktivität in Drosophila-Gewebehomogenaten

Zusammenfassung

Quelle: Wei, P., et al., Ein kolorimetrischer Assay der Citratsynthase-Aktivität in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video beschreibt einen kolorimetrischen Assay zur Messung des mitochondrialen Citratsynthase-Aktivitätsassays, der im Gewebehomogenat von Drosophila vorhanden ist.

Protokoll

1. Kolorimetrischer Citratsynthase-Aktivitätsassay für D. melanogaster

1. Sammle für jede Probe zehn erwachsene Fliegen. Sammeln Sie mindestens dreifache Proben für jeden Genotyp.
2. Bereiten Sie für jede Probe 500 μl eiskalten Extraktionspuffer mit 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA und 0,1 % Triton X-100 in einem 1,5-ml-Reagenzglas vor.
3. Betäuben Sie erwachsene Fliegen mit CO₂ auf einem Anästhesiepad und isolieren Sie das gewünschte Gewebe. Um zum Beispiel die adulten Fliegenthoraxe zu isolieren, fixieren Sie die Fliegenthoraxe mit einer Pinzette und isolieren Sie dann den Fliegenbauch, indem Sie mit einer Schere entlang der Grenze des Thorax und des Abdomens schneiden. Sammeln Sie die Fliegen-Thoraxe für den Muskelcitrat-Synthase-Aktivitäts-Assay.
   Anmerkung: Bestimmen Sie das Frischgewicht des Gewebes in diesem Schritt, wenn Sie es zur Normalisierung der Citratsynthase-Aktivität verwenden.
4. 10 adulte Fliegenthoraxes sofort auf 100 μl eiskalten Extraktionspuffer umfüllen und mit einem Stößel auf Eis homogenisieren. Um die Proben eiskalt zu halten, homogenisieren Sie die Proben 5-10 s lang auf Eis, lassen Sie die Proben dann 5 s auf Eis ruhen und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Gewebe im Röhrchen vollständig homogenisiert sind.
   Anmerkung: Kleben Sie das Röhrchen mit Klebeband ab, überprüfen Sie die Homogenate, um sicherzustellen, dass sich keine Gerinnsel in den Homogenaten befinden und dass das Gewebe im Röhrchen vollständig homogenisiert ist. Alle Probenbehandlungen sollten auf Eis durchgeführt werden.
5. Entnehmen Sie 10 μl jeder homogenisierten Probe in ein neues Röhrchen zur Messung des Proteingehalts. Bewahren Sie die Proben für die Proteinmessung auf Eis auf.
   Anmerkung: Die Proteinproben können eingefroren und bei -80 °C für eine spätere Analyse gelagert werden. Die Proteinkonzentrationen dienen als interner Parameter für die Normalisierung der Citratsynthase-Aktivitäten.
6. Geben Sie 400 μl eiskalten Extraktionspuffer zu jeder verbleibenden Probe, um ein Gesamtvolumen von 500 μl zu erhalten. Mischen Sie gut, indem Sie mindestens 5x vorsichtig auf und ab pipettieren, um Blasenbildung zu vermeiden. Für jede Reaktion 1 μl verdünntes Zelllysat zu 150 μl der frisch zubereiteten Reaktionslösung (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM DTNB, 0,3 mM Acetyl-CoA, 1 mM Oxalessigsäure) hinzufügen. Mischen Sie gründlich und sofort durch vorsichtiges Pipettieren, um Blasenbildung zu vermeiden. Messen Sie die Extinktion bei 412 nm alle 10-30 s für 4 min bei 25 °C mit einem Plattenlesegerät, das in der Lage ist, die Extinktion bei 412 nm in Mindestabständen von 10 s zu messen
   Anmerkung: Wechseln Sie die Spitze, bevor Sie ein anderes Reagenz pipettieren, und vermeiden Sie die Bildung von Blasen in den Wells. Unvollständiges Mischen der Reagenzien kann zu Messabweichungen führen. Der Citratsynthase-Aktivitätstest sollte unmittelbar nach der Probenentnahme bei Raumtemperatur durchgeführt werden, da dieser Assay zur Quantifizierung der intakten mitochondrialen Masse verwendet wird. Der Reaktionspuffer sollte unmittelbar vor der Verwendung hergestellt und nicht gelagert werden.
7. Plotten Sie die Daten als optische Dichte (OD), Absorption (abs) (Y-Achse) über Zeit (in Minuten) (X-Achse). Berechnen Sie dann die Steigung für den linearen Teil der Kurve, wobei die Reaktionsgeschwindigkeit beträgt
   
   Teilen Sie den Wert durch die Proteinkonzentration der Probe, um die Citratsynthase-Aktivität zu normalisieren. Die Citratsynthase-Aktivität wird wie folgt berechnet
   
   Anmerkung: Die Proteinkonzentration der Probe kann mit einem Proteinkonzentrations-Assay-Kit gemessen werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethansulfonsäure (HEPES)	Sigma-Aldrich	V900477
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol (TRIZMA Base)	Sigma-Aldrich	V900483
Acetyl-CoA	Sigma-Aldrich	Nr. A2181
Dithio-bis-nitrobenzoesäure (DTNB)	Sigma-Aldrich	Nr. D8130
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Sigma-Aldrich	V900106
Oxalacetat	Sigma-Aldrich	Nr. O4126
Pellet-Stößel	Sangon	F619072
Stößelmotor für Pellets	Tiangen	OSE-Y10
Teller-Lesegerät	BioTek	Äon
Protein BCA Assay Kit	Beyotime	P0010S
Schere	WPI	Artikel-Nr.: 14124
Triton X-100	Sangon	A110694-0100