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1. Inokulation von Zellen
- Beginnen Sie mit einer Kultur von humanen Epithelzellen A549 in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) hoher Glukose mit Phenolrot, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) ohne Antibiotika.
- Beobachten Sie jede Vertiefung der 24-Well-Platte mit Mikroskopie mit geringer Vergrößerung, um sicherzustellen, dass die menschlichen Epithelzellen gesund sind und wie erwartet wachsen.
- Entfernen Sie das verbrauchte Zellkulturmedium und entsorgen Sie es von der 24-Well-Platte.
- 500 μl der in DMEM ohne Phenolrot hergestellten Bakteriensuspension von Staphylococcus aureus zur Inokulation in jede Vertiefung mit 100 % konfluenten Zellen zugeben.
- Inkubieren Sie die Zellen 2 Stunden lang bei 36 ± 1 °C und 5 % CO2,
HINWEIS: Es wird empfohlen, für jede zu testende Bedingung drei Vertiefungen der Platte zu verwenden (dreifach) und mindestens drei unabhängige Experimente durchzuführen. Die Verzögerung der Inkubation kann je nach experimentellem Ziel angepasst werden.
2. Quantifizierung intrazellulärer Bakterien mit verbessertem Enzymschutzassay (iEPA)
- Bereiten Sie 7 ml 4x Lysepuffer mit 3,5 ml 2% Triton X-100 in sterilem Wasser und 3,5 ml Trypsin-EDTA vor.
- Bereiten Sie eine Lysostaphin-Stammlösung mit 10 mg/ml in Acetatpuffer vor und aliquotieren Sie 25 μl in Kryoröhrchen. Bei -80 °C bis zu 6 Monate lagern.
- Bereiten Sie 250 μl einer frischen Lysostaphin-Arbeitslösung zu 1 mg/ml vor, indem Sie 25 μl der Lysostaphin-Stammlösung (10 mg/ml) und 225 μl 0,1 M Tris-HCl mischen. Bei 4 °C bis zu 48 h lagern.
- Bereiten Sie 6,25 ml vollständiges Infektionsmedium vor, das mit Lysostaphin ergänzt wird, indem Sie 6 ml vollständiges Infektionsmedium zu 250 μl der Lysostaphin Arbeitslösung hinzufügen.
- Geben Sie 250 μl vollständiges Infektionsmedium, das mit Lysostaphin versetzt ist, in jede Vertiefung und bewegen Sie die Platte vorsichtig, indem Sie die Platte von Hand schwenken.
- Inkubieren Sie die Zellen 1 h lang bei 36 ± 1 °C in 5 % CO2, damit das Lysostaphin die extrazellulären Bakterien abtöten kann.
- Am Ende der Inkubationszeit geben Sie 10 μl Proteinase K mit 20 mg/ml in jede Vertiefung, um das Lysostathin zu inaktivieren.
- Inkubieren Sie die Zellen 2 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie 250 μl 4x Lysepuffer hinzu, um die Zellen durch osmotischen Schock zu lysieren.
- Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 36 ± 1 °C.
- Mischen Sie gründlich, indem Sie zehnmal auf und ab über den Boden der Vertiefung pipettieren, um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig lysiert und homogenisiert sind.
- Verwenden Sie einen automatischen Spiralplattenteller, um die S. aureus-Belastung jeder Vertiefung zu bestimmen.
- Die Agarplatten werden 18-24 Stunden bei 36 ± 1 °C inkubiert.
- Zählen Sie am nächsten Tag die Anzahl der Kolonien mit einem Koloniezähler, um die intrazelluläre S. aureus-Last jeder Vertiefung zu berechnen.