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Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft
1. Vorbereitung der Lösung
HINWEIS: Behandeln und bereiten Sie alle Reagenzien und Lösungen mit eisenfreien Glaswaren oder Einwegplastik vor. Lassen Sie metallische Labormaterialien (z. B. Spatel aus Edelstahl) nicht mit Reagenzien oder Lösungen in Berührung kommen, da die Gefahr einer Eisenkontamination besteht. Stellen Sie sicher, dass alle wiederverwendbaren Gläser bügelfrei sind. Waschen Sie die Materialien 30-60 Minuten lang mit geeignetem Laborwaschmittel, spülen Sie sie mit entionisiertem Wasser ab, weichen Sie sie über Nacht in einer 37%igen Salpetersäurelösung ein, die 1:3 mit entionisiertem Wasser verdünnt ist, spülen Sie sie erneut mit entionisiertem Wasser ab und lassen Sie sie trocknen.
- Säuremischung: 10 g Trichloressigsäure zu 82,2 ml 37%iger Salzsäure in eine Glasflasche geben, gründlich auflösen und das Endvolumen mit entionisiertem Wasser auf 100 ml einstellen. Vor Gebrauch schütteln. Alternativ können Sie nur 37%ige Salzsäure für die Gewebeverdauung verwenden.
Anmerkung: Die Lösung ist mindestens 2 Monate haltbar, wenn sie in dunkelbraunen Glasreagenzflaschen gelagert wird.
Vorsicht: Salzsäure und Trichloressigsäure sind ätzend, und konzentrierte Formen setzen giftige saure Dämpfe frei. Tragen Sie beim Umgang mit Säuren immer Schutzkleidung, chemikalienbeständige Handschuhe und eine Schutzbrille. Vermeiden Sie es, sie einzuatmen und gehen Sie immer mit Säuren um, wenn Sie sich unter einem Abzug befinden.
- Gesättigtes Natriumacetat: Geben Sie 228 g wasserfreies Natriumacetat in eine Glasflasche und rühren Sie es über Nacht bei Raumtemperatur. Lassen Sie die Lösung einen Tag ruhen und ausfällen. Wenn keine Niederschlagung auftritt, fügen Sie weiterhin kleine Mengen Natriumacetat hinzu. Bewahre die Lösung in einer Glasflasche auf.
- Chromogen-Reagenz: Zur Herstellung von 1 ml Chromogen-Reagenz 1 mg 4,7-Diphenyl-1,10-phenanthrolin-disulfonsäure-Dinatriumsalz zu 500 μl deionisiertem Wasser und 10 μl konzentrierter (100 %) Thioglykolsäure hinzufügen und gründlich auflösen. Füllen Sie das Endvolumen auf 1 mL mit entionisiertem Wasser auf.
Anmerkung: Bereiten Sie so viel Chromogen-Reagenz vor, wie Sie benötigen. Die Lösung ist 1 Monat lang stabil, wenn sie vor Licht geschützt ist.
- Chromogen-Arbeitsreagenz (WCR): Geben Sie 1 Volumen des Chromogen-Reagenzes zu 5 Volumen gesättigtem Natriumacetat und 5 Volumen deionisiertem Wasser.
Anmerkung: Diese Lösung sollte am Tag der Anwendung frisch zubereitet werden.
- Stammeisen-Standardlösung: Zur Herstellung einer 20 mM Stammeisenlösung werden 111,5 mg Carbonyleisenpulver in einen 250 ml-Messkolben gegeben, der 5.480 μl 37%ige Salzsäure enthält. Über Nacht bei Raumtemperatur auflösen lassen (oder in einem kochenden Wasserbad inkubieren). Füllen Sie dann die Lösung mit entionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 mL auf.
Anmerkung: Die Standardlösung kann unbegrenzt aufbewahrt werden, wenn sie in einem dicht verschlossenen Gefäß gelagert wird.
- Arbeitseisen-Standardlösung (WISS): Fügen Sie 13,5 μl 37%ige Salzsäure zu 500 μl deionisiertem Wasser hinzu. 10 μl der Eisenstandard-Stammlösung zugeben und das endgültige Volumen mit deionisiertem Wasser auf 1 ml auffüllen (11,169 μg Fe/ml, 200 μM; gemessen mit AAS).
Anmerkung: Die Arbeitslösung sollte am Tag der Anwendung frisch zubereitet werden.
2. Trocknung der Probe
- Schneiden Sie mit einer Skalpellklinge eine Gewebeprobe mit einem Gewicht von 10-100 mg. Wiegen Sie es genau in einer analytischen/präzisen Waage über einem kleinen Stück Parafilm (Fresh Weight).
- Legen Sie das Gewebestück mit einer Plastikpinzette in eine 24-Well-Platte (ohne Deckel, damit das Wasser verdunsten kann) und lassen Sie es auf einem handelsüblichen Inkubator bei 65 °C 48 h trocknen.
- Alternativ können Sie zum Trocknen von Gewebeproben einen Mikrowellen-Aufschlussofen im Labor verwenden. Legen Sie das gewogene Taschentuchstück mit einer Plastikpinzette in einen eisenfreien Teflonbecher und trocknen Sie es in der Mikrowelle. Stellen Sie die Betriebsparameter gemäß der Bedienungsanleitung des Geräts ein.
Anmerkung: Als Referenz sind die Betriebsparameter für die Trocknung von Leberproben mit dem spezifischen Aufschlussofen (siehe Materialtabelle) in Tabelle 1 aufgeführt.
- Legen Sie jedes getrocknete Stück Gewebe mit einer Plastikpinzette auf ein kleines Stück Parafilm in einer Analyse-/Präzisionswaage und wiegen Sie es genau ab (Trockengewicht).
3. Saurer Aufschluss der Probe
- Übertragen Sie jedes getrocknete Gewebestück mit einer Kunststoffpinzette in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie 1 ml des Säuregemisches hinzu und verschließen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie auf die gleiche Weise einen Säurerohling vor, nur dass das Gewebe weggelassen wird.
Vorsicht: Das Säuregemisch ist ätzend und setzt giftige Dämpfe frei. Tragen Sie Schutzkleidung, chemikalienbeständige Handschuhe und eine Schutzbrille, wenn Sie mit dem Säuregemisch umgehen. Vermeiden Sie es, es einzuatmen, und fassen Sie es immer unter einem Abzug.
- Verdauen Sie das Gewebe, indem Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in einem Inkubator bei 65 °C für 20 h inkubieren.
- Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden 500 μl des klaren (gelben) Säureextrakts (Überstand) mit einer Mikropipette mit Kunststoffspitzen in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Ist es nicht möglich, einen klaren Überstand zu erhalten, wird eine kurze Zentrifugationsdrehung durchgeführt.
Vorsicht: Der Überstand ist stark sauer. Tragen Sie Schutzkleidung, chemikalienbeständige Handschuhe und eine Schutzbrille, wenn Sie mit den Überständen umgehen. Fassen Sie sie immer unter einem Abzug an.
Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt können die Säureextrakte sofort für den kolorimetrischen Assay verwendet oder bei -20 °C für die spätere Verwendung eingefroren werden. Tauen Sie gefrorene Proben vor der Verwendung vollständig auf Raumtemperatur auf und wirbeln Sie sie ein.
4. Farbentwicklung
- Bereiten Sie Chromogenreaktionen, wie in Tabelle 2 angegeben, in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor oder, für einen höheren Durchsatz, direkt in die klaren, unbehandelten Polystyrol-Mikrotiterplatten mit flachem Boden. Bereiten Sie alle Reaktionen (Säureblindwert, Standard und Probe) mindestens in zweifacher Ausführung vor.
- 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Messung der Absorption
- Messen Sie die Probenabsorption in einem Spektralphotometer oder Plattenlesegerät bei einer Wellenlänge von 535 nm gegen eine Referenz für deionisiertes Wasser. Die Platten können ohne Deckel oder mit Deckel gelesen werden. Entfernen Sie im Gehäuse mit Deckel das Kondenswasser, das durch die Freisetzung von Säuredämpfen aus dem Deckel unmittelbar vor der Messung gebildet wurde, um eine mögliche Beeinträchtigung der Absorptionsmessung zu vermeiden.
Anmerkung: Die optische Absorption des Säureblindwerts gegen deionisiertes Wasser (Referenz) sollte weniger als 0,015 betragen; Die optische Extinktion des Standards und der Proben sollte zwischen 0,100 und 1,000 liegen. Bei Proben mit sehr hohem oder sehr niedrigem Eisengehalt müssen die Volumina von Säureextrakt (Überstand) und diH2O möglicherweise angepasst werden (Tabelle 2): Wenn die Extinktion größer als 1,0 ist, ist ein kleineres Probenvolumen (Überstand) zu verwenden. Wenn die Extinktion kleiner als 0,1 ist, ist ein höheres Volumen des Überstands zu verwenden. Das Probenvolumen (Vsmp) wird bei der Berechnung des Eisengehalts im Gewebe jeder Probe berücksichtigt (siehe Schritt 6).
6. Berechnung des Eisengehalts im Gewebe
- Berechnen Sie den Eisengehalt des Nicht-Häm-Gewebes mit der folgenden Gleichung:
Gewebeeisen (μg/g trockenes Gewebe) = Gleichung 1
AT = Extinktion der Probe
AB = Absorption von Säure blank
AS = Absorption von Norm
Fes = Eisenkonzentration von WISS (μg Fe/mL)
W = Gewicht des Trockengewebes (g)
Vsmp = Probenvolumen (variables Volumen des Überstands in Tabelle 2, umgerechnet in ml)
Vf = endgültiges Volumen des Säuregemisches nach Inkubation über Nacht bei 65 °C (entspricht dem Säurevolumen plus dem Volumen des Trockengewebes in mL; wenn sich die Probengewichte nicht wesentlich unterscheiden, ist von einem konstanten Volumen ≈ 1 ml auszugehen)
Vstd = Eisenstandardvolumen (Volumen von WISS in Tabelle 2 umgerechnet in mL)
Vrv = endgültiges Reaktionsvolumen (Gesamtvolumen in Tabelle 2 umgerechnet in mL)
Tabelle 1: Betriebsparameter für die Lebertrocknung in einem hier verwendeten Mikrowellenaufschlussofen
| Leistung 650W (%): | 10 | Nr. 15 | 20 | 25 | 30 |
| Druck (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Zeit (min): | 10 | Nr. 15 | 30 | 30 | 40 |
| Zeit bei Druck (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Ventilator: | Nr. 50 | Nr. 50 | Nr. 50 | Nr. 50 | Nr. 50 |
Tabelle 2: Vorbereitung von Chromogenreaktionen in 1,5-ml-Röhrchen oder 96-Well-Platten.
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
| | WCR (μL) | Säuregemisch (μL) | Überstand (μL) | WISS (μL) | diH2O (μL) | Gesamtvolumen (μL) |
| 1,5 mL Röhrchen | Säure-Rohling | 1000 | 150 | | | 150 | 1300 |
| Norm | 1000 | 150 | | 150 | | 1300 |
| Probe | 1000 | | Variable | | Variable | 1300 |
| 96-Well-Mikroplatte | Säure-Rohling | 150 | 22,5 | | | 22,5 | Nr. 195 |
| Norm | 150 | 22,5 | | 22,5 | | Nr. 195 |
| Probe | 150 | | Variable | | Variable | Nr. 195 |