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Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
1. Expansion von OC-Vorläuferzellen
- Resuspendieren Sie PBMCs in vollständigem α-MEM (10 % FBS, 1 % Pen/Strep, 1 % Amphotericin B) mit 20 ng/mL M-CSF. PBMCs mit einer Dichte von 2,5 x 105 Zellen/cm2 aussäen. In der Regel können Zellen, die aus 15-20 ml frischem Blut isoliert wurden, in einen 75 cm2 Kolben (1,5-2 x 107 Zellen) ausgesät werden.
- Füttern Sie die Zellen jeden dritten Tag mit frischem vollständigem α-MEM, das 20 ng/mL M-CSF enthält, bis die angehängten Zellen eine gewünschte Konfluenz erreichen. Typische Ausbeuten sind 1,5-2 x106 Zellen/Kolben, wenn die Zellen zu 95 % konfluent sind. In der Regel dauert die Expansionsphase 6 Tage.
Anmerkung: Das osteoklastogene Potenzial der Vorläufer kann mit zunehmender Kultivierungszeit abnehmen.
2. Induktion der Osteoklastogenese in Calciumphosphat-beschichteten Platten
- Um die Zelladhäsion zu erleichtern, inkubieren Sie die mit Calciumphosphat (CaP) beschichteten Platten mit 50 μl FBS für 1 h in einem 37 °C Inkubator.
- Um die OC-Vorläufer zu lösen, wird der Kolben zweimal mit PBS gewaschen, um abgestorbene oder nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Fügen Sie 4 ml Trypsin (Materialtabelle) pro 75 cm2 Kolben für 30 Minuten hinzu.
- Fügen Sie 4 ml vollständiges α-MEM hinzu, um die Verdauung zu stoppen, lösen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Zellschaber ab und geben Sie die Zellen in ein 50-ml-Röhrchen.
- Bestimmen Sie die Gesamtzellzahl mit Hilfe einer Neubauer-Kammer o.ä.
- Die Zellen werden durch Zentrifugation für 7 min bei 350 x g pelletiert. Das Pellet wird in ausreichend vollständigem α-MEM mit 20 ng/mL M-CSF und 20 ng/mL RANKL resuspendiert, um eine Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml zu erhalten.
- Aspirieren Sie die FBS-Lösung von der CaP-beschichteten 96-Well-Platte und pipettieren Sie 200 μl Zellsuspension pro Well (2 x 10,5 Zellen/Well).
- Inkubieren Sie die OC-Vorläufer für den gewünschten Zeitraum oder mit den gewünschten Reagenzien, die für das Versuchsdesign relevant sind. In der Regel kann eine hohe Anzahl von großen und mehrkernigen OCs nach 6 Tagen und bei der Bildung von Resorptionsgruben beobachtet werden. Füttern Sie die Zellen jeden dritten Tag mit frischem vollständigem α-MEM-Medium, das 20 ng/mL M-CSF und 20 ng/ml RANKL enthält.
- Am Ende der Inkubation die Zellen zweimal mit PBS waschen, 10 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixieren und erneut mit PBS waschen.
- Verwenden Sie die fixierten OCs direkt für die Fluoreszenzfärbung oder lagern Sie sie bei 4 °C.
3. Fluoreszenzfärbung von OCs und Calciumphosphatbeschichtung
- Inkubieren Sie die fixierten Zellen mit Permeabilisierungspuffer (0,1 % Triton in PBS) für 5 Minuten.
- Färben Sie Aktinfilamente mit 100 μl AlexaFluor 546-markierter Phalloidinlösung in PBS für 30 min und aspirieren Sie die Färbelösung. Geben Sie 100 μl Hoechst 33342 Färbelösung (10 μg/ml in PBS) für 10 Minuten zur Färbung der Zellkerne. Auch DAPI kann verwendet werden.
- CaP-Beschichtung mit 100 μl 10 μM Calcein in PBS für 10 min färben. Dreimal mit PBS waschen und Bilder aufnehmen.