Die Verwendung von radioaktivem Material (RAM) erfordert die vorherige Genehmigung durch ein benanntes Sicherheitskomitee an jeder Institution.
1. Herstellung von Stammlösungen für 14C-markierte Substrate
- Stellen Sie 4 mM Rinderserumalbumin (BSA)-Stammlösung her, indem Sie 11 g BSA und 33,1 ml Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) mischen und bei Raumtemperatur ~3 h lang vorsichtig schütteln, bis BSA vollständig aufgelöst ist. Erwärmen Sie die BSA-Stammlösung vor Gebrauch in einem 70 °C warmen Wasserbad.
- 50 μCi 14C-Oleat (50 μCi/μmol in Ethanol) in der Durchstechflasche bei abgenommenem Deckel 8 Stunden lang in einer dafür vorgesehenen RAM-Arbeitshaube an der Luft trocknen. Fügen Sie 312,5 μl H2O und dann 3,5 mg (11,5 μmol) Natriumoleat hinzu. Gründlich mischen.
- Erwärmen Sie die resultierende Lösung in einem Wasserbad auf 70 °C. Fügen Sie 0,9375 ml der vorgewärmten BSA-Stammlösung hinzu, um 10 mM heiße Oleat-Stammlösung zu erhalten (mit einem Verhältnis von 1:11,5 von 14C-Oleat zu unmarkiertem Oleat). Aliquotieren Sie die Stammlösung und lagern Sie sie für den Langzeitgebrauch bei -20 °C.
- Verwenden Sie 14C-Glucose und 14C-Glutamin direkt nach dem Auftauen.
2. Herstellung eines Mediums mit 14C-markierten Substraten
HINWEIS: Um zuverlässige Konzentrationen von Energiesubstraten in den Medien zu gewährleisten, müssen maßgeschneiderte Medien mit frischen Substraten verwendet werden, die kurz vor der Verwendung hinzugefügt werden. Hier wird ein maßgeschneidertes Minimum Essential Medium (MEMα) ohne Glukose, Pyruvat, Glutamin, Phenolrot oder Natriumbicarbonat verwendet. Für jeden Zelltyp sollte jedoch ein optimales Medium bestimmt werden.
- 8,67 g des Mediumpulvers in 1 l gereinigtem Wasser rekonstituieren. Fügen Sie 2,2 g Natriumbicarbonat hinzu, um einen pH-Wert von 7,4 zu erreichen, und filtrieren Sie die Lösung mit einer Vakuumfiltration von 0,22 μm.
- Fügen Sie frische Zutaten hinzu, um das vollständige Medium (cMEMα) mit Endkonzentrationen von 5,5 mM Glukose, 2 mM Glutamin, 1 mM Pyruvat und 10 % fötalem Rinderserum (FBS) zu erhalten. Ergänzen Sie cMEMα weiter mit 100 mM L-Carnitin und 10 μM HEPES, um die Fettsäureoxidation zu erleichtern.
- Unmittelbar vor der Verwendung 14C-markierte Substrate zu frisch vorbereitetem cMEMα hinzufügen, um heiße Medien herzustellen. Um das Oleat zu einem heißen Medium zu machen, geben Sie die 10 mM heiße Oleat-Stammlösung zu cMEMα für eine Endkonzentration von 100 μM Oleat (1:100 Verdünnung, Endradioaktivität 0,4 μCi/ml).
Anmerkung: Das 10 mM heiße Oleatmaterial, das ein Verhältnis von heißem: kaltem Oleat von 1:11,5 enthält (siehe Schritt 1.3), wird verwendet, um ein physiologisches Niveau von 100 μM Gesamtoleat im Medium zu erreichen und gleichzeitig die Menge an radioaktivem Material zu minimieren.
- 10 mM unmarkierte Ölbrühe herstellen, indem 24,36 mg Natriumoleat zu 2 ml H2O in einem Wasserbad bei 70 °C für ~20 min hinzugefügt werden, bis sie sich vollständig aufgelöst haben, bevor sie schnell mit 6 mL der auf 70 °C vorgewärmten 4 mM BSA-Stammlösung gemischt werden. 1 h lang in ein 37 °C-Wasserbad geben und durch einen 0,22 μm Filter filtrieren. Aliquotieren und für den Langzeitgebrauch bei -20 °C lagern.
- Um Glukose zu einem heißen Medium zu machen, fügen Sie 14C-Glukose bis zu einer Endkonzentration von 1,333 μM hinzu (1:4.125 Verdünnung, endgültige Radioaktivität 0,4 μCi/ml). Um Glutamin heißes Medium herzustellen, fügen Sie 14C-Glutamin bis zur Endkonzentration von 2 μM hinzu (1:1.000 Verdünnung, endgültige Radioaktivität 0,4 μCi/ml).
- Ergänzen Sie das heiße Medium mit Glukose und Glutamin mit einer 10 mM Stammlösung aus unmarkiertem Oleat aus Schritt 2.4, um die Endkonzentration von 100 μM Oleat zu erreichen, die der im heißen Medium mit Oleat entspricht.
3. Vorbereitung der Zellen
HINWEIS: Kalvariale Präosteoblasten und Knochenmarkmakrophagen werden hier als Beispiele verwendet. Die Benutzer sollten den Zelltyp ihrer Wahl gemäß den entsprechenden Protokollen vorbereiten. Optimieren Sie die Konzentration von Kollagenase II, die in Pilotversuchen für die Verdauung verwendet werden soll, da die enzymatische Aktivität zwischen verschiedenen Chargen variieren kann.
- Isolierung und Kultivierung von kalvarialen Präosteoblasten
- Opfern Sie die Welpen nach der Geburt 3-5 (P3-5) durch Enthauptung und bringen Sie sie in eiskalte DPBS, die Penicillin-Streptomycin (P/S) enthalten.
- Legen Sie die Schädeldecke frei, indem Sie die Haut und das Weichgewebe entfernen. Sammeln Sie die mittlere Region, indem Sie das umgebende Gewebe in DPBS von hinten nach vorne wegschneiden (Abbildung 1A). Kratzen Sie die Innen- und Außenflächen der Schädeldecke vorsichtig mit einer Pinzette an, um die Zellen bei der anschließenden Verdauung freizusetzen.
- Bereiten Sie eine 2 mg/ml- und eine 4 mg/ml-Lösung von Kollagenase Typ II in DPBS vor und filtrieren Sie jede Lösung mit einem frischen 0,22-μm-Filter. Verdauen Sie die gereinigte Schädeldecke zuerst mit der 2 mg/ml-Kollagenaselösung für 15 min und verwerfen Sie die Aufschlusslösung. Verdauen Sie die gereinigten Proben 3 Mal für jeweils 15 Minuten in 4 mg/ml-Kollagenaselösung, sammeln Sie die Aufschlusslösung und bewahren Sie sie auf.
- Die Aufschlusslösung wird durch 70 μm Zellsiebe filtriert und das Filtrat 5 min lang bei 300 × g zentrifugiert. Das Zellpellet wird in cMEMα (siehe Schritt 2.2) mit 10 % FBS und P/S resuspendiert.
- Zählen und entkernen Sie die Zellen in 4 × 104 Zellen/cm2 in 10 cm Platten. Kultivieren Sie die Zellen in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 für 3 Tage.
- Dissoziieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 0,25 % Trypsin-EDTA. Zählen und säen Sie die Zellen in 24-Well-Zellkulturplatten mit cMEMα mit 10 % FBS und P/S bei 7,5 × 105/cm2. Säen Sie mindestens 4 Wells pro Zelltyp und Substrat und mindestens drei zusätzliche Wells für jeden Zelltyp für die Zellzählung vor dem Assay aus.
- Kultivieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C, bevor Sie die Substratoxidationstests durchführen.
- Isolation und Kultur von BMMs
HINWEIS: Für die Kultivierung von BMMs ist ein Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF) erforderlich, der als rekombinantes Protein kommerziell erworben werden kann. Konditioniertes Medium aus der Zelllinie CMG14-12, das für die Expression von M-CSF entwickelt wurde, ist hier eine wirtschaftliche Alternative.
- Sammeln Sie Femure und Tibias von 8 Wochen alten Mäusen, nachdem Sie das Muskel- und Bindegewebe entfernt haben. Schneide beide Enden der Knochen mit einer scharfen Schere ab und entsorge sie.
- Spülen Sie das Knochenmark aus einem Oberschenkelknochen und einem Schienbein in eine 10 cm große Petrischale mit einer Spritze, die mit einer 23-G-Nadel ausgestattet ist, die 15 ml cMEMα mit 10 % FBS, P/S und 10 % CMG14-12 konditioniertem Medium (BMM-Medium) enthält. Kultivieren Sie die Zellen in der Petrischale in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2.
- Entsorgen Sie nach 3 Tagen den Nährboden und spülen Sie ihn mit DPBS aus. Dissoziieren Sie die angehängten Zellen bei 37 °C mit 0,25 % Trypsin-EDTA für 5 min. Zentrifugieren Sie das Küvettenpellet und resuspendieren Sie es im BMM-Medium.
- Die Zellen werden in 24-Well-Zellkulturplatten bei 7,5 × 105/cm2 auf die gleiche Weise wie in 3.1.6 beschrieben gezählt und ausgesät. Vor Beginn der Assays bei 37 °C über Nacht im BMM-Medium kultivieren.
4. Substratoxidationsassay mit CO2 -Falle
HINWEIS: Für jeden Zelltyp sollte eine geeignete Seeding-Dichte bestimmt werden, um vor Beginn des Assays eine Konfluenz von 80-90% zu erreichen. Beachten Sie, dass die Zelldichte den Stoffwechselzustand der Zellen beeinflussen kann.
- Waschen Sie die Zellen in den extra Wells zweimal mit DPBS. Dissoziieren Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA und mischen Sie 20 μl Zellen, die in DPBS resuspendiert sind, mit 20 μl Acridinorange/Propidiumiodid (AO/PI), gebrauchsfertiger kommerzieller Farbstofflösung. Bestimmen Sie die Anzahl der lebenden Zellen mit einem automatisierten Zellzähler und notieren Sie die Anzahl für abschließende Berechnungen.
- Waschen Sie die Zellen in den Assay-Wells zweimal mit DPBS. Geben Sie 500 μl heißes Medium in jede Assay-Vertiefung in der RAM-spezifischen Gewebekulturhaube. Verschließen Sie die Platten mit Parafilm und inkubieren Sie die Zellen in einem RAM-Inkubator bei 37 °C für 4 h.
- Schneiden Sie während der Inkubation das Filterpapier in kreisförmige Stücke, die etwas größer sind als die Fläche innerhalb der Kappe von 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, und führen Sie das Papier fest in die Kappe ein (Abbildung 1B). Geben Sie 200 μl 1 M Perchlorsäure in jedes Röhrchen und 20 μl Natriumhydroxid in das Filterpapier in der Kappe.
- Nach der Inkubation der Zellen werden 400 μl Kulturmedium aus jeder Vertiefung in die vorbereiteten Röhrchen überführt und die Verschlüsse sofort verschlossen. Lassen Sie die Röhrchen 1 h bei Raumtemperatur in einem Röhrchengestell.
- Stellen Sie während der Inkubation für jedes Röhrchen ein Szintillationsfläschchen auf und füllen Sie es mit 4 mL Szintillationsflüssigkeit. Jedes Stück Filterpapier in ein Szintillationsfläschchen geben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Führen Sie Wischtests an der Gewebekulturhaube, dem Wasserbad (für die Herstellung von 14C-Oleaten), dem Kühlschrank, dem Inkubator, der Spüle, dem Boden und allen anderen Arbeitsbereichen auf mögliche RAM-Kontamination durch. Legen Sie die Papiertücher in Szintillationsfläschchen mit Szintillationsflüssigkeit.
- Messen Sie 14C Radioaktivität in den Szintillationsfläschchen mit einem Szintillationszähler. Notieren Sie die Messergebnisse. Dekontaminieren Sie die Arbeitsumgebung bei Bedarf gemäß den Strahlenschutzrichtlinien.
