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Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft
1. Vorbereitung der LED für die Blaulichtbeleuchtung
- Schalten Sie ein LED-Panel ein, indem Sie die zugehörige Anwendung verwenden, die auf einem Tablet/Telefon installiert ist. Setzen Sie die Sonde eines Spektrometers in eine leere Vertiefung einer 6-Well-Schüssel ein und stellen Sie das LED-Licht durch die Anwendung auf die Wellenlängenspitze bei ~456 nm ein. Platzieren Sie den optischen Sensor eines optischen Leistungsmessers in der leeren Vertiefung und stellen Sie die Leistung des LED-Lichts ein (~0,61 mW/cm2). Die LED-Lichteinstellung kann gespeichert werden und ist in der Anwendung abrufbar.
- Stellen Sie die Schüssel-/LED-Panel-Einstellung auf 28 °C in den Inkubator ein. Beenden Sie diesen Schritt, bevor die Bildgebung der Fische bei 48 hpf beginnt.
2. Bildgebung von Zebrafischlarven, die optogenetisches TDP-43 exprimieren
- Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doppelt transgene Fische mindestens vor 47 hpf auswählen, basierend auf RFP (opTDP-43h) oder EGFP (EGFP-TDP-43z) Fluoreszenz in der spinalen motorischen Säule unter Verwendung des Epifluoreszenzmikroskops, das mit einer Plan-Neofluar 5x/0,15 Objektivlinse ausgestattet ist.
- Dechorionieren Sie den Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doppelt transgenen Fisch.
- Agarose mit 1 % niedriger Schmelztemperatur und 250 μg/ml Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonatsalz auf 42 °C vorheizen.
- Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] doppelt transgene Fische bei 48 hpf in E3-Puffer mit der gleichen Konzentration an Tricane kurzzeitig anästhesieren.
- Einen Tropfen der vorgeheizten Agarose mit niedriger Schmelztemperatur von 1 % auf die Glasbodenschale bei Raumtemperatur geben. Der Durchmesser des kuppelförmigen Agarosetropfens auf der Glasschale beträgt 8-10 mm.
- Geben Sie den anästhesierten Fisch mit einer Pasteur-Pipette auf die niedrige Schmelztemperatur Agarose auf der Glasbodenschale und mischen Sie ihn dann durch mehrmaliges Pipettieren. Minimieren Sie die Menge des E3-Puffers, der der Agarose zusammen mit dem Fisch zugesetzt wird.
- Halten Sie den Fisch auf der Seite, indem Sie während der Verfestigung der Agarose (typischerweise ~1 min) eine Spritzennadel verwenden, um sicherzustellen, dass sich das Rückenmark in einer geeigneten horizontalen Position befindet. Nach dem Erstarren geben Sie ein paar Tropfen E3-Puffer auf den kuppelförmigen Agarose-Fisch
.
- Erfassen Sie serielle konfokale Z-Schnitte des Rückenmarks durch Scannen mit einem konfokalen Mikroskop, das mit einer 20-fachen Wasserimmersionsobjektive mit einer numerischen Apertur von 1,00 ausgestattet ist, mit einer Scangeschwindigkeit von 4,0 μs pro Pixel (12 Bit pro Pixel), einer Schrittweite von 1,0 μm pro Schicht für das Objektiv und einer Kombination von Anregungs-/Emissionswellenlängen: Kanal 1) 473/510 nm für EGFP und Kanal 2) 559/583 nm für mRFP1.
Anmerkung: Die Kloake auf der ventralen Seite des Fisches ist in den Regionen von Interesse (ROI) als Referenz enthalten, was hilft, die Wirbelsäulensegmente (Ebenen 16-17) über die Zeitpunkte hinweg zu identifizieren und zu vergleichen.
- Entfernen Sie den Fisch aus der Agarose, indem Sie die Agarose vorsichtig mit einer Spritzennadel knacken, sobald die Bildgebung abgeschlossen ist. Halten Sie die Zeit, in der der Fisch in der Agarose eingebettet ist, so kurz wie möglich, obwohl die Agarose-Einbettung für <30 min die Lebensfähigkeit des Fisches nicht beeinträchtigt.
3. Lichtstimulation von opTDP-43h-exprimierenden Fischen durch Feldbeleuchtung einer blauen Leuchtdiode (LED)
- Geben Sie 7,5 ml E3-Puffer in die Vertiefung und geben Sie den abgebildeten Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doppeltransgenen Fisch in die Vertiefung. Platzieren Sie die Sechs-Well-Schale auf dem LED-Panel, indem Sie die Schale und das LED-Panel mit einem Abstandshalter von 5 mm Abstand halten (z. B. mit fünf gestapelten Diagläsern).
- Schalten Sie das blaue LED-Licht ein. Bewahren Sie einen Teil der Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doppelt transgenen Fische in einer separaten Sechs-Well-Schale auf, die mit Aluminiumfolie abgedeckt ist, wenn unbeleuchtete Kontrollfische erforderlich sind (d. h. bei dunklen Bedingungen).
- Nach der Beleuchtung (z. B. für 24 h bei 72 hpf in Abbildung 1) wird das Rückenmark des beleuchteten Fisches abgebildet, indem die Schritte 2.3 - 2.9 wiederholt werden.
