Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft
1. In-vitro-Screening kleiner Moleküle
- Bereiten Sie die Assay-Platten vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Gießen Sie autoklaviertes destilliertes Wasser in einen sterilen Trog und geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 40 μl destilliertes Wasser aus dem Trog in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit flachem Boden ab.
- Bereiten Sie das Pinning-Tool vor und fügen Sie die Chemikalien hinzu.
Stellen - Sie Stiftkassetten (siehe Materialtabelle) in der Nähe einer Bunsenbrennerflamme auf einem Labortisch auf. Fügen Sie folgenden Pinner Trays Folgendes hinzu: 25 ml Stiftreinigungslösung, 35 ml 50 % DMSO (in Wasser), 45 ml destilliertes Wasser, 55 ml 70 % EtOH und 65 ml 95 % EtOH. Legen Sie ein Stück Löschpapier vor jedes Fach.
- Reinigen Sie das Pinning-Werkzeug, indem Sie die Stifte in die Reinigungslösung eintauchen und die Stifte dreimal (3x) in der Lösung auf und ab bewegen. In diesem Protokoll sind "3x" und "10x" so definiert, dass der Pinner in einer Lösung drei- bzw. zehnmal auf und ab bewegt wird. Tupfen Sie die Stecknadeln auf das Löschpapier. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal.
- Spülen Sie anschließend die Stecknadeln 3x in destilliertem Wasser ab, anschließend tupfen Sie die Stecknadeln ab. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal.
- Zum Schluss spülen Sie die Pins 3x in 95% EtOH und tupfen Sie die Pins anschließend ab. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal. Flammen Sie den Pinner ab und lassen Sie das Ethanol verdampfen.
- Geben Sie Chemikalien aus den 96-Well-Chemikalien-Vorratsplatten zu den Assay-Platten, indem Sie 3x in die Chemikalienplatte stecken und dann die Pins 10x in die Assay-Platte übertragen. Tupfen Sie es vor der Reinigungslösung auf Papier.
- Reinigen Sie das Pinnwerkzeug zwischen den Platten, indem Sie es in der folgenden Reihenfolge waschen und zwischendurch auf Löschpapier tupfen: 3x in 50% DMSO (einmal), 3x in destilliertem Wasser (einmal), 3x in 75% EtOH (einmal), 3x in 95% EtOH (zweimal). Flammen Sie den Pinner ab und lassen Sie das Ethanol verdampfen.
- Wiederholen Sie Schritt 1.2.2, wenn das Anheften abgeschlossen ist.
Anmerkung: Das Screening wurde bei einer Endkonzentration von 60 μM durchgeführt.
- Zugabe von Würmern
- Zählen Sie die Anzahl der Nematoden aus der Sammlung, indem Sie zuerst 5 μl resuspendieren und dann mit Spitzen mit geringer Retention zur Beobachtung auf einen Objektträger pipettieren. Zählen Sie die Anzahl der Nematoden in 5 μl mit einem Dissektionsmikroskop.
- Stellen Sie die Konzentration mit sterilem destilliertem Wasser auf 2 Würmer/μl ein. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette und einem Trog 10 μl (~20 Würmer) in jede Vertiefung der 96-Well-Platten.
Anmerkung: Pro Kulturplatte werden etwa 15.000 D. dipsaci-Nematoden mit der beschriebenen Kultur- und Entnahmemethode gesammelt. Pro Vertiefung werden zwanzig Würmer verwendet, da die geringe Anzahl die übersichtliche Visualisierung und Abrechnung von mobilen und immobilen Würmern erleichtert.
- Verschließen Sie die Platten in Laborfolie und wickeln Sie sie mit einem feuchten Papiertuch ein. In die Schachtel legen und auf einem Klebepad im 20°C Schüttelinkubator mit 200 U/min anbringen. Stellen Sie sicher, dass die Teller in der Box stabilisiert sind, indem Sie ein zusätzliches feuchtes Papiertuch hinzufügen, um eine minimale Bewegung der Platten zu gewährleisten.
2. Datenerfassung und -analyse
- Betrachten Sie die Platten an Tag 5 unter einem Präpariermikroskop. Zählen Sie die Anzahl der mobilen und die Gesamtzahl der D. dipsaci in DMSO-Lösungsmittelkontrollen und medikamentös behandelten Vertiefungen.
- Wenn die Würmer relativ unbeweglich sind, geben Sie 2 μl 1 M NaOH bis zu einer Endkonzentration von 40 mM in die Vertiefung, um die Bewegung zu stimulieren.
Anmerkung: Nach der Zugabe von NaOH bewegen sich die Würmer sofort und müssen innerhalb von 5 Minuten betrachtet werden. Die Anzahl der mobilen Würmer und die Gesamtzahl der Würmer werden verwendet, um den Anteil der mobilen Würmer zu berechnen. Die Länge des Assays kann sich je nach Ziel des Screenings ändern.
- Berechnen Sie den Anteil der mobilen Würmer. In den D. dipsaci-Sieben werden Vertiefungen, die reproduzierbar 0% mobile Würmer ergaben, als starke Treffer eingestuft.
Anmerkung: Eine längere Exposition der Platten auf dem Tisch von Dissektionsmikroskopen wird vermieden, da die Lichtquelle die Platten erwärmen und variable Effekte auf den Bioassay hervorrufen kann.
