In-vitro-Mineralisierungsassay: Eine kolorimetrische Methode zur Quantifizierung von Osteoblasten-Kalziumablagerungen auf Knochentransplantatersatz durch Alizarinrot-Färbung und -Extraktion

Zusammenfassung

Quelle: Kampleitner, C. et al. Biologisches Kompatibilitätsprofil auf Biomaterialien für die Knochenregeneration. J. Vis. Exp. (2018)

In diesem Video beschreiben wir eine Methode zum Nachweis von Osteoblasten-sezernierten Kalziumablagerungen mit einem anionischen Farbstoff, Alizarin Red S. Die kultivierten Osteoblasten werden zuerst gefärbt und dann wird der Farbstoff für die kolorimetrische Quantifizierung von Kalziumablagerungen oder des Grades der Osteoblastenmineralisierung zurückgewonnen.

Protokoll

1. Osteoblasten-Mineralisierungsassay

1. Inkubieren Sie Scheiben aus β-Tricalciumphosphat (β-TCP) mit einem Durchmesser von 14 mm in 1 ml Knochenwachstumsmedium (BGM) in einer 24-Well-Suspensionskulturplatte bei 37 °C und 5 % CO₂ für 24 Stunden, bevor Sie die Osteoblasten (OBs) hinzufügen. Verwenden Sie Standard-Gewebekulturplatten für Kontrollen und Suspensionskulturplatten für die Biomaterialproben, um eine Anhaftung der Zellen an den Kunststoff zu vermeiden.
2. Aspirieren Sie das Vorinkubationsmedium und resuspendieren Sie dann die primären Maus-OBs in BGM. Geben Sie 8,8 x 10⁴ OBs/cm² auf die vorinkubierten β-TCP-Platten in einer 24-Well-Suspensionskulturplatte und für die Kontrollgruppe auf eine 24-Well-Gewebekulturplatte (1 ml/Well). OBs werden an der Gewebekulturplatte oder der Biomaterialprobe befestigt.
3. Ersetzen Sie das BGM 24 h nach der Zugabe der OBs durch 1 ml osteogenes Mineralisierungsmedium (MM), das BGM, 50 μg/mL Ascorbinsäure und 5 mM β-Glycerophosphat enthält, und inkubieren Sie es 14 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO₂. Wechseln Sie das Medium alle 2–3 Tage mit 1 ml frisch zubereitetem MM in jede Vertiefung
.

2. Osteoblastenmineralisierung, beurteilt durch Färbung mit Alizarin Red S (ARS)

1. Aspirieren Sie das Kulturmedium 14 Tage nach der Zugabe von MM aus den Vertiefungen, die primäre OBs enthalten, und spülen Sie zweimal mit 0,5 ml 1x PBS bei RT. Aspirieren Sie das PBS und fixieren Sie die Zellen, indem Sie 0,5 ml der 10%igen gepufferten Formalinlösung bei RT für 10 Minuten hinzufügen.
2. Aspirieren Sie das 10% gepufferte Formalin mit einer Einwegpipette und waschen Sie es zweimal mit 0,5 ml Reinstwasser.
3. Zu den fixierten OBs werden 0,25 ml 40 mM ARS-Färbelösung (pH 4,2) gegeben, die in Reinstwasser gelöst ist, und die Platte 10 Minuten lang bei RT auf einem Schüttler bei 100 Schütteln/min inkubiert.
4. Aspirieren Sie die Färbelösung mit einer Einwegpipette und spülen Sie sie mit 1 ml Reinstwasser ab. Wiederholen Sie diesen Schritt 5–10 Mal, um unspezifische Flecken zu entfernen.
   Anmerkung: Die Spüllösung sollte ohne Farbe sein.
5. Aspirieren Sie das Reinstwasser und fügen Sie 1 ml kaltes PBS hinzu. Inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei RT auf einem Shaker bei 100 Schütteln/min.
6. Aspirieren Sie das PBS, übertragen Sie die gefärbten β-TCP-Platten in ein neues Bohrloch und scannen Sie die Platten mit einem Flachbettscanner, um die Mineralisierung aufzuzeichnen.
7. Fügen Sie 0,25 ml 10%ige Cetylpyridiniumchloridlösung hinzu und inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei RT auf einem Schüttler mit 100 Schütteln/min, um den ARS-Farbstoff zu extrahieren.
8. Die Überstände werden in ein 1,5-ml-Röhrchen überführt und bei 17.000 x g für 5 min bei RT zentrifugiert.
9. Geben Sie 10 % Cetylpyridiniumchlorid-Lösung mit einem Verdünnungsverhältnis von 1:10 bis 1:20 zu den Extrakten und geben Sie die Proben (300 μl) in eine 96-Well-Platte, die zwei Blindvertiefungen enthält, die nur 10 % Cetylpyridiniumchlorid enthalten.
10. Bereiten Sie 7 ARS-Referenzstandards im Bereich von 4 bis 400 μM vor, indem Sie die 40 mM ARS-Färbelösung (pH 4,2) mit 10 % Cetylpyridiniumchloridlösung verdünnen, um eine Standardkurve zu erzeugen.
11. Geben Sie 300 μl des Referenzstandards in Duplikaten auf die 96-Well-Platte.
12. Lesen Sie die Extinktion der Proben, Blindproben und Referenzstandards bei 520 nm ab.
13. Subtrahieren Sie die Blindmesswerte von den Referenzstandards und den Probenmesswerten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
β-Tricalciumphosphat-Scheiben (β-TCP, 14 mm)			Die Scheiben wurden in einem Muffelofen bei einer Temperatur von 1150 °C gesintert und vor der Verwendung in Zellkulturen mit UV-Strahlung (15 min pro Seite) bestrahlt
Alizarin Rot S	Sigma-Aldrich	Nr. A5533
Knochenwachstumsmedium (BGM)			α-MEM + 10 % hitzeinaktiviertes FBS + 1 % Penicillin/Streptomycin
Formalinlösung neutral gepuffert 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Hexadecylpyrdinium (Cetylpyridinium)-chlorid-Monohydrat	Sigma-Aldrich	Nr. C9002
L-Ascorbinsäure, 2-Phosphat, Sesquimagnesiumsalz, Hydrat	Sigma-Aldrich	Nr. A8960
MEM alpha Medium (α-MEM)	Gibco Life Technologien	Tel.: 11900-073
Osteogenes Mineralisierungsmedium (MM)			α-MEM + 10 % hitzeinaktiviertes FBS + 1 % Penicillin-Streptomycin + 50 μg/ml Ascorbinsäure + 5 mM β-Glycerophosphat
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	Nr. P4333
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
β-Glycerophosphat-Dinatriumsalzhydrat	Sigma-Aldrich	Nr. G5422
Reinstwasser: Zellkulturwasser pyrogenfrei	VWR	Nr. L0970-500
96-Well-transparente Platte	Greiner bio-one	655001
24-Well-Suspensionskulturplatte	Greiner bio-one	662102
24-Well-Gewebekulturplatte	Greiner bio-one	Artikel-Nr.: 662160
Zentrifuge: VWR Mega Star 600R	VWR
CO2-Inkubator: HeraCell 240	Thermo Scientific
Flachbettscanner: Epson Perfection 1200 Foto	Epson
Infinite M200 Pro Mikroplatten-Reader	Tecan
Mikrozentrifugenröhrchen: Eppendorf Röhrchen Safe-Lock 1,5 mL	VWR	Tel.: 21008-959
Schüttel-Inkubator GFL3032	DaF	3032
Einwegpipette: Serumpipette	Greiner bio-one	612301