1. Vorbereiten von Kügelchen für die Gelimplantation
- Nehmen Sie eine Kultur mit Microcarrier-Kügelchen, die mit humanen Nabelvenendothelzellen (HUVEC) und Perizyten beschichtet sind.
- Untersuchen Sie die Schalen mit den Microcarrier-beschichteten Kügelchen unter dem Mikroskop mit dem 20X-Objektiv, um sicherzustellen, dass alle Kügelchen ausreichend von Endothelzellen beschichtet wurden.
- Pipettieren Sie die plattierte Lösung der Zellen kräftig, um sie von der 6-cm-Platte zu lösen, und geben Sie die Lösung in ein Röhrchen. Waschen Sie die Platte 2x weitere Male mit dem vollständigen Medium und geben Sie sie in die Tube, um alle Restperlen zu sammeln, die möglicherweise an der Platte haften.
- Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen und verwenden Sie eine p1000-Pipette, um die Scherbelastung der mit Endothelzellen beschichteten Kügelchen zu minimieren.
- Warten Sie 3 Minuten, bis sich die Kügelchen in der Lösung am Boden des Röhrchens absetzen können.
- Entfernen Sie mit einer Pipettenspitze p1000 so viel Überstand wie möglich, ohne das Kügelchen zu stören (verwenden Sie keinen Vakuumsauger).
- Geben Sie 1 ml des vollständigen Mediums in jedes Röhrchen und resuspendieren Sie die Kügelchen.
- Warten Sie 30-60 Sekunden, bis sich die Perlen am Boden absetzen können. Entfernen Sie dann mit einer P1000-Pipette so viel Überstand wie möglich, ohne das Kügelchen zu stören. Verwenden Sie keinen Vakuumsauger, da die Wahrscheinlichkeit, dass das Bead-Pellet versehentlich entfernt wird, stark erhöht ist.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.6 und 1.7 zwei weitere Male. Ziel ist es, so viel wie möglich von den frei schwebenden HUVEC-Kügelchen zu entfernen, die sich möglicherweise von der 6-cm-Platte gelöst haben, ohne dabei zu viele HUVEC-beschichtete Kügelchen zu entfernen, die sich in den FACS-Röhrchen (Fluorescence Activated Cell Sorting) mit rundem Boden schneller absetzen sollten als in frei schwebenden Zellen.
- Geben Sie 1 ml des vollständigen Mediums zu den Perlen.
2. Einbetten von beschichteten Kügelchen in ein Fibringel
- Entfernen Sie mit einer P1000-Pipette so viel Medium wie möglich, ohne das Bead-Pellet in jedem FACS-Röhrchen zu stören.
- Resuspendieren Sie die Kügelchen in 2,5 ml Fibrinogenlösung.
- Pipettieren Sie 13 μl Thrombinlösung in jede gewünschte Vertiefung einer 24-Well-Glasbodenplatte. Die Beschichtung in einer Platte mit Glasboden ist unerlässlich, um eine optimale Abbildung der Sprossen zu ermöglichen.
HINWEIS: Lassen Sie Thrombin nicht länger als 5-10 Minuten in einer Vertiefung liegen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Geben Sie 0,5 ml Bead-/Fibrinogenlösung in jede Vertiefung.
- Achten Sie darauf, die Bead-Lösung gut zu resuspendieren, bevor Sie die Lösung jedes Mal pipettieren.
- Seien Sie vorsichtig, wenn Sie vorsichtig direkt in das bereits in der Vertiefung vorhandene Thrombin pipettieren. Pipettieren Sie langsam 2-3 Mal auf und ab, um die Lösung gründlich zu mischen, und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen entstehen.
- Achten Sie darauf, die Pipettenspitze zwischen den Vertiefungen zu wechseln.
- Achten Sie darauf, die Platte während der anfänglichen Fibringerinnung zu keinem Zeitpunkt zu bewegen oder zu stören, da jede Bewegung die Gelbildung stören kann.
- Lassen Sie die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur in der Haube stehen.
- Übertragen Sie die Platte vorsichtig für weitere 1,5 bis 2 Stunden in einen 37 °C-Inkubator, damit sich das Gel vollständig verfestigen kann
3. Beschichtung von Fibroblasten auf dem Fibringel
- Während der letzten 30 Minuten nach der Verfestigung des Gels lösen Sie normale humane Lungenfibroblasten (NHLF) wie folgt ab:
- Waschen Sie einen T175-Kolben mit Zellen mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), fügen Sie dann 5 ml Zellablösungslösung hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 °C.
- Resuspendieren Sie NHLF in einer Konzentration von 20.000 Zellen/ml in vollständigen Medien.
HINWEIS: NHLF-Zellen können mit Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) kultiviert werden, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt wird.
- Geben Sie 1 ml der NHLF-Zellsuspension auf das Gel jeder Vertiefung und legen Sie es zurück in den Inkubator.
- Wechseln Sie das komplette Medium alle zwei Tage für die Dauer des Assays.
