1. Larvenkontakt-Assay (Einzelpunkt-Dosis- oder Dosis-Wirkungs-Assay)
HINWEIS: Der Assay kann mit Chemikalien durchgeführt werden, die in Wasser oder Dimethylsulfoxid (DMSO) löslich sind, vorausgesetzt, dass die Endkonzentration von DMSO in den Testvertiefungen 1% nicht überschreitet. Alternative Lösungsmittel können eine Option sein, aber es ist wichtig, zunächst zu bestätigen, dass die Endkonzentration 72 Stunden nach der Exposition nicht mehr als 10 % Mortalität verursacht. Der Assay kann als Einzelpunkt-Dosis- oder Dosis-Wirkungs-Assay durchgeführt werden. Bei letzterem wird empfohlen, einen Konzentrationsbereich (mindestens fünf) zu testen, der den erwarteten LC50 umfasst.
- Beschriften Sie die Vertiefungen einer durchsichtigen 24-Well-Gewebeplatte.
- Bereiten Sie eine Stammlösung der Testchemie in einem 1,5-ml-Röhrchen vor.
- Wiegen Sie jede Chemikalie mit einer Analysenwaage und suspendieren Sie sie je nach Löslichkeitseigenschaften in sterilem ddH2O, DMSO oder einem anderen geeigneten organischen Lösungsmittel Ihrer Wahl.
Anmerkung: Bei den Berechnungen sollte die Reinheit der Chemie berücksichtigt werden. Für eine Chemie, die zu 99 % rein ist, lösen Sie beispielsweise 10,1 mg in 1.000 μl Aceton auf, um eine 1%ige Lösung zu erhalten. Mit Paraffinfolie verschließen und bei -20 °C lagern.
- Bestimmen Sie die Endkonzentration der Prüfchemie, die bewertet werden soll, und bereiten Sie entsprechend Reihenverdünnungen aus der Stammlösung unter Verwendung des geeigneten Lösungsmittels vor.
Anmerkung: Die Konzentration und das Volumen der Chemie und des Lösungsmittels können mit der Formel C1 * V1 = C2 * V2 berechnet werden, wobei C1 = Konzentration von Probe 1, C2 = Konzentration von Probe 2, V1 = Volumen von Probe 1 und V2 = Volumen von Probe 2 berechnet wird.
- Bereiten Sie eine 10 mM-Stammlösung und serielle Verdünnungen nach Bedarf vor, um die gewünschten Testkonzentrationen zu erhalten (Tabelle 1B).
- Übertragen Sie mit einer Kunststoff-Transferpipette mit breiter Bohrung fünf L3-Larven in die Vertiefung einer Gewebekultur-Testplatte. L3-Larven sind an der Länge (~ 2,5 - 3,5 mm) und der Breite der Kopfkapsel von ~ 0,025 mm zu erkennen. Entfernen Sie das Wasser vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette und ersetzen Sie es durch das gewünschte Volumen von ddH2O. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um n = 4 technische Wiederholungen pro Behandlung zu erhalten (d. h. insgesamt 20 Larven pro Behandlung).
- Geben Sie das entsprechende Volumen der Testchemie in jedes der vier Repliz-Wells in der 24-Well-Testplatte und schwenken Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Durchmischung der Chemie zu gewährleisten. Stellen Sie die Platte unter konstanten Bedingungen in eine Test- oder Wachstumskammer (z. B. 25 °C und ~ 75-85 % relative Luftfeuchtigkeit wird empfohlen, und wenn möglich ein 12 h heller/12 h dunkler Zyklus).
Anmerkung: Um die Reproduzierbarkeit zwischen den Experimenten zu gewährleisten, stellen Sie sicher, dass nachfolgende Assays unter denselben Umgebungsbedingungen durchgeführt werden.
- Notieren Sie die Anzahl der toten/nicht ansprechbaren Larven in jeder Vertiefung 30 min, 1, 1,5, 2, 3, 24, 48 und 72 h nach der Exposition (oder zu alternativen Zeitpunkten) auf dem Bewertungsblatt (Tabelle 2). Klopfen Sie vorsichtig auf die Seite der Platte. Wenn keine Bewegung beobachtet wird, berühren Sie die Larve vorsichtig mit einem sterilen Zahnstocher. Larven, die nicht auf Klopfen/Berührung reagieren, werden als "tot" eingestuft.
Anmerkung: Andere morphologische und verhaltensbezogene Phänotypen können beobachtet und aufgezeichnet werden.
- Korrigieren Sie die Kontrollmortalität bei Bedarf mit der modifizierten Abbott-Formel wie folgt:
Mortalität (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
wobei X = die prozentuale Mortalität in der behandelten Stichprobe und Y = die prozentuale Mortalität in der Kontrolle.
- Stellen Sie die Ergebnisse als Histogramm oder logarithmische Kurve mit einer Software Ihrer Wahl wie Graph-pad Prism 6 oder einer ähnlichen dar und berechnen Sie die Werte der Letalkonzentration (LC) relativ zur Kontrolle.
- Wiederholen Sie den Assay mit einer separaten Charge von Mücken, um n = 3 oder mehr biologische Replikate zu erhalten.
Tabelle 1. Beispielberechnungen für Aedes aegypti L3-Larven (A) Einzelpunkt-Dosisassay und (B) Dosis-Wirkungs-Assay.
| A. Einzelpunkt-Dosisassays mit drei Chemikalien |
| Chemie | Konzentration (400 μM) |
| Amitriptylin | 80 mM Bestand: 2 mg Amitriptylin X 98% (Reinheit des Pulvers) X 0,001 g/1 mg X 1 mol /313,86 g X 1 L/0,08 mol X 106 μL/L = 78,06 μl Wasser. |
| Serienverdünnungen: Verdünnen Sie das Material 1:2 mit ddH2O und dann 1:4, um 10 mM zu erreichen. Geben Sie 40 μl 10 mM-Stamm in die Vertiefung mit 960 μl ddH20, um eine Endkonzentration von 400 μM/Vertiefung zu erreichen. Bereiten Sie serielle Verdünnungen von 10 mM Stamm 1:2 vor, um 5 mM, 2,5 mM, 1,25 mM und 0,625 mM Rohlinge zu erreichen. |
| Cis-(z)-flupenthixol | 80 mM Bestand: 2 mg cis(z)flupenthixol x 98% (Reinheit des Pulvers) x 0,001 g/1 mg x 1 mol/507,44 g cis(z)flupenthixol x 1L/0,08 mol x 106 μl/l = 48,28 μl Wasser. |
| Serienverdünnungen: Wie oben. |
| Amitraz | 80 mM Bestand: 2 mg Amitraz X 0,001 g/1 mg X 1 mol/293,4 g Amitraz X 1 L/0,08 mol X 106 μL/1 L = 85,21 μL DMSO (Hinweis: Amitraz ist nur in DMSO löslich). |
| Serienverdünnungen: Wie oben. |
| B. Dosis-Wirkungs-Assay |
| Chemie | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 |
| 400 μM | 200 μM | 100 μM | 50 μM | 25 μM |
| z.B. Amitriptylin, cis-(Z)-flupenthixol oramitraz | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL |
| 10 mM Lagerbestand | 5 mM Lagerbestand | 2,5 Mio. Lagerbestand | 1,25 Mio. Lagerbestand | 0,625 mM Lagerbestand |
Tabelle 2. Beispiel für ein Scoresheet, das zum Aufzeichnen von Daten aus dem Dosis-Wirkungs-Assay für Mückenlarven verwendet wird. Kontrolle, nur Wasser oder Wasser mit 1 % DMSO oder nur mit einem anderen Lösungsmittel. Typische Dosen, die zum Testen von niedermolekularen Antagonistenchemien wie Amitriptylin verwendet werden, sind 25 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM und 400 μM.
kg
kg
kg
kg
kg
kg
| Mücke L3 Larven-Assay |
| Datum der Initiierung: |
| Ermittler: |
| Spezies/Stamm: |
| Assay-Typ: Einzelpunkt-Dosis/Dosis-Verhältnis |
- Mortalität (Anzahl toter Mücken)
| | |
| Zeit (Stunden) | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 | Steuerung |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1,5 | | | | | | |
| arabische Ziffer | | | | | | |
| 2,5 | | | | | | |
| 3 | | | | | | |
| 12 | | | | | | |
| 24 | | | | | | |
| 48 | | | | | | |
| 72 | | | | | | |
- Prozentuale Sterblichkeit
|
| Zeit (Stunden) | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 | Steuerung |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1,5 | | | | | | |
| arabische Ziffer | | | | | | |
| 2,5 | | | | | | |
| 3 | | | | | | |
| 12 | | | | | | |
| 24 | | | | | | |
| 48 | | | | | | |
| 72 | | | | | | |
