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Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft
1. Kultur der erwachsenen Mücken
HINWEIS: Insektizidempfindliche Mückenstämme sind im Malaria Research and Reagent Reference Repository erhältlich. Empfohlene Stämme sind wie folgt: Aedes aegypti Liverpool (LVP) Stamm, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) Stamm und Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) Stamm.
- Kultivieren Sie Mückenlarven aus Eiern in einem 12 h Tag/12 h Nachtzyklus bei 28 °C und 75-85% relativer Luftfeuchtigkeit (RH) in 25 cm x 40 cm großen Kunststoffschalen (~ 400 Larven pro Tablett), wie von Nuss beschrieben. Füttern Sie die Larven mit gemahlener Rennmaus (A. aegypti und An. gambiae) oder flockigem Fischfutter (C. quinquefasciatus). Für Larventests sind die Larven im Stadium der dritten Larve (L3) zu sammeln.
- Aufzucht adulter Mücken von Puppen, die in Plastikbecher umgefüllt und unter den oben beschriebenen Bedingungen in 20-Liter-Plastikkäfigen in einem Insektar untergebracht wurden. Halten Sie Mücken auf 20%iger Zuckerlösung, wie an anderer Stelle beschrieben. Sammeln Sie die erwachsenen Tiere 3-5 Tage nach dem Auflaufen.
2. Topischer Assay für Erwachsene (Einzelpunktdosis- oder Dosis-Wirkungs-Assay)
HINWEIS: Der topische Assay für Erwachsene wird mit Aceton als Lösungsmittel durchgeführt. Alternative Lösungsmittel können eine Option sein, aber es ist wichtig, zunächst zu bestätigen, dass die Endkonzentration 48 Stunden nach der Exposition nicht mehr als 10 % Mortalität verursacht. Der Assay kann als Einzelpunkt-Dosis- oder Dosis-Wirkungs-Assay durchgeführt werden und wird zur Bestimmung der letalen Dosis (LD) verwendet. Bei letzterem wird empfohlen, einen Konzentrationsbereich (mindestens fünf) zu testen, der sich über die erwartete LD50 erstreckt.
- Bestimmen Sie die Anzahl der erwachsenen weiblichen Mücken, die erforderlich sind, um den Test abzuschließen.
Anmerkung: Für einen Punktdosis-Assay mit einer einzigen Chemie sind mindestens 90 Mücken erforderlich (30 für die Positivkontrolle, 30 für die reine Aceton-Negativkontrolle und 30 für die Testchemie).
- Kultivieren Sie 3 bis 5 Tage alte erwachsene weibliche Mücken und geben Sie sie mit einem Aspirator in einen separaten 20-ml-Plastikeimer (Abbildung 1).
- Beschriften Sie 9-Unzen-Pappbecher mit dem Namen und der Konzentration der Testchemie. Für jeden Becher 10 cm x 10 cm Maschenquadrate und Gummibänder beiseite legen (siehe Abbildung 2).
- Wählen Sie ein vorhandenes Insektizid als Positivkontrolle (z. B. das synthetische Pyrethroid Bifenthrin) und bereiten Sie eine 1%ige Stammlösung (10 μg/μl) in Aceton vor.
HINWEIS: Bei den Berechnungen sollte die Reinheit der Chemie berücksichtigt werden. Für eine Chemie, die zu 99 % rein ist, lösen Sie beispielsweise 10,1 mg in 1.000 μl Aceton auf, um eine 1%ige Lösung zu erhalten. Mit Paraffinfolie verschließen und bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie nach dem gleichen Verfahren wie oben eine Stammlösung der Prüfchemikalie vor.
Anmerkung: Viele Testchemikalien sind sehr labil, und die Lösungen sollten vorzugsweise bei jeder Durchführung des Bioassays frisch gemacht werden.
- Bereiten Sie serielle Verdünnungen der Positivkontroll- und Prüfchemie aus Stammlösungen vor, wie in Abbildung 3 gezeigt, unter Verwendung von 20-ml-Glasfläschchen, die zuvor mit Aceton gespült wurden.
- Spülen Sie eine 1-ml-Glasspritze mit Aceton, füllen Sie sie mit Aceton und befestigen Sie sie im Mikroapplikator, der so eingestellt ist, dass ein Volumen von 0,25 μl abgegeben wird.
In - Zehnergruppen werden 3 bis 5 Tage alte erwachsene weibliche Mücken mit einem Sauger aus den Käfigen entfernt und bis zu fünf Minuten lang bei 4 °C im Kühlschrank oder auf Eis betäubt. Anschließend die Mücken in eine Petrischale geben und bis zu 10 Minuten auf Eis legen.
- Gehen Sie schnell vor, entfernen Sie eine einzelne Frau mit einer feinen Pinzette und tragen Sie 0,25 μl Testlösung mit dem Mikroapplikator der Spritze auf den dorsalen Thorax auf. Bestätigen Sie die Abgabe der Chemie durch Beobachtung mit einem Präpariermikroskop, um sicherzustellen, dass jede Mücke die richtige Menge an Testchemie erhält.
- Übertragen Sie die Mücke in einen beschrifteten Pappbecher, der auf Eis ruht, und wiederholen Sie den Vorgang neunmal, um n = 10 behandelte Mücken zu erhalten. Verschließen Sie die Mücken im Becher mit einem mit einem Gummiband befestigten Maschenquadrat und bringen Sie sie unter konstanten Bedingungen von 28 °C und 75-85 % relativer Luftfeuchtigkeit in eine Plastikwanne oder Wachstumskammer (bei einem 12-stündigen Tages-/12-Stunden-Nachtzyklus ist vorzuziehen).
- Wiederholen Sie das obige Experiment zweimal, um n = 3 technische Wiederholungen (d. h. insgesamt 30 Mücken) pro Behandlungs- oder Kontrollgruppe zu erhalten.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.7 - 2.10 zuerst mit der Testchemie und dann mit der Positivkontrolle.
Anmerkung: Eine weitere nützliche Kontrolle, die einbezogen werden sollte, wenn genügend Mücken verfügbar sind, ist eine "Leerprobe" von 30 anästhesierten Mücken, die weder Testchemie noch Lösungsmittel erhalten.
- Notieren Sie die Anzahl der "toten/nicht ansprechbaren" Mücken 30 Minuten, 60 Minuten, 2, 24 und 48 Stunden nach der Exposition (oder zu alternativen Zeitpunkten) anhand des Bewertungsbogens (Tabelle 1). Bewerten Sie Mücken als "tot/nicht ansprechbar", wenn sie Bewegungsmangel zeigen, d.h. auf einer Seite oder auf dem Rücken liegend und mit der Unfähigkeit zu fliegen.
- Falls gewünscht, korrigieren Sie die Kontrollmortalität mit der modifizierten Abbott-Formel wie folgt:
Mortalität (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
wobei X = die prozentuale Mortalität in der behandelten Stichprobe und Y = die prozentuale Mortalität in der Kontrolle.
- Zeigen Sie die Ergebnisse als Histogramm oder Exponentialkurve an. Berechnen Sie für einen Dosis-Wirkungs-Assay den LD50-, LD 75- oder LD90-Wert für die Testchemie relativ zur Kontrolle.
- Wiederholen Sie den Assay mindestens zweimal mit separaten Chargen von Mücken, um n = 3 oder mehr biologische Replikate zu erhalten.
