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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
1. Blutfütterungsassay für Erwachsene (Einzelpunktdosis- oder Dosis-Wirkungs-Assay)
- Sammeln Sie etwa 150 4-5 Tage alte erwachsene weibliche Mücken und bringen Sie sie in einen separaten Käfig. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um 6 Käfige zu erhalten, wenn Sie einen Dosis-Wirkungs-Assay durchführen. Entfernen Sie die Zuckerquelle 1-24 h vor dem Fütterungstest.
- Bereiten Sie eine chemische Stammlösung wie oben beschrieben unter Berücksichtigung der Reinheit der Chemikalie vor (eine typische Stammlösung ist 80 mM in Wasser oder Salzpuffer) und bereiten Sie anschließend nach Bedarf serielle Verdünnungen in Wasser/Puffer vor.
- 40 μl jeder der Verdünnungen werden zu 960 μl defibriertem Kaninchenblut gegeben, um die gewünschte Testkonzentration zu erhalten. Membranfolie auf eine Zuführeinheit aufbringen und mit einem Gummiring verschließen. Übertragen Sie 1 ml Blut per Pipette und befestigen Sie die Fütterungseinheit an einer Heizeinheit.
- Tupfen Sie die Membranoberfläche vorsichtig mit frisch hergestellter 10%iger Milchsäurelösung ab und stellen Sie die Fütterungseinheit in den Käfig der erwachsenen Mücken. Decken Sie den Käfig mit einem dunklen Tuch oder einem schwarzen Müllsack ab und lassen Sie die Mücken eine Stunde lang fressen.
- Die Schritte 1.2 bis 1.4 sind für die restlichen Testlösungen und die negative Kontrolle (nur Blutkontrolle) zu wiederholen.
- Stellen Sie nach Beendigung der Fütterung Eimer bei 4 °C für 5 Minuten in den Kühlschrank, um die Mücken zu betäuben. Entfernen Sie männliche Mücken und nicht gefütterte weibliche Mücken und zählen und erfassen Sie die Gesamtzahl der gefütterten und teilweise gefütterten Mücken durch Untersuchung des Abdomens.
- Halten Sie teilweise und vollständig gefütterte weibliche Mücken zurück, wobei mindestens 50 blutgefütterte Mücken pro Dosis angestrebt werden.
- Bringen Sie die Eimer unter konstanten Bedingungen von 28 °C und 75 - 85 % relativer Luftfeuchtigkeit in eine Kunststoffwanne oder Wachstumskammer (bei einem 12-stündigen Tag-/12-Stunden-Nachtzyklus ist vorzuziehen).
- Notieren Sie die Gesamtzahl der toten/nicht ansprechbaren Mücken nach 0,5, 1, 1,5, 2, 24, 48 und 72 Stunden (oder zu alternativen Zeitpunkten nach Wunsch) anhand des Bewertungsblatts (Tabelle 1).
- Führen Sie am dritten Tag nach der Blutfütterung einen Eierbecher in den Käfig ein und sammeln Sie die Eier über einen Zeitraum von 72 Stunden. Zählen Sie die Gesamtzahl der pro Behandlung produzierten Eizellen unter einem Präpariermikroskop.
- Berechnen Sie die prozentuale Mortalität und Fruchtbarkeit als Funktion der Gesamtzahl der gefütterten Mücken für jede Behandlungsgruppe und die Kontrolle. Korrigieren Sie die Kontrollmortalität bei Bedarf mit der modifizierten Abbott-Formel.
- Anzeige von Toxizitäts- und Fruchtbarkeitsdaten als Histogrammdiagramm oder Exponentialkurve (bei Durchführung eines Dosis-Wirkungs-Assays) mit einer Software Ihrer Wahl. Wenn Sie einen Dosis-Wirkungs-Assay durchführen, berechnen Sie den LD50-, LD75- oder LD90-Wert für die Testchemie relativ zur Kontrolle.
- Wiederholen Sie den Assay mindestens zweimal mit separaten Chargen von Mücken, um n = 3 oder mehr biologische Replikate zu erhalten.
Tabelle 1. Beispiel für ein Scoresheet, das zum Aufzeichnen von Daten aus dem Blutfütterungstest bei Erwachsenen verwendet wird.Typische Dosen, die zum Testen von niedermolekularen Antagonistenchemien wie Amitriptylin verwendet werden, sind 50 μM, 100 μM, 200 μM und 400 μM.
kg
kg
kg
kg
kg
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| Mücke Erwachsene (3-5 Tage alt) Topischer Assay |
| Datum der Initiierung: |
| Ermittler: |
| Spezies/Stamm: |
| Assay-Typ: Einzelpunkt-Dosis/Dosis-Wirkungs-Verhältnis |
| A. Sterblichkeit (Anzahl toter Mücken) |
| Zeit (Stunden) | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 | Steuerung |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1,5 | | | | | | |
| arabische Ziffer | | | | | | |
| 2,5 | | | | | | |
| B. Prozentuale Sterblichkeit |
| Zeit (Stunden) | Dosis 1 | Dosis 2 | Dosis 3 | Dosis 4 | Dosis 5 | Steuerung |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1,5 | | | | | | |
| arabische Ziffer | | | | | | |
| 2,5 | | | | | | |