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1. Produktion von Lentiviren
HINWEIS: Die Produktion und Manipulation von lentiviralen Vektoren wurde gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) für die Forschung mit rekombinanter DNA durchgeführt. Es wird das Plasmid verwendet, das für die Wildtyp- und A4V-Mutante SOD1 kodiert, die mit verstärktem YFP (SOD1WT-YFP und SOD1A4V-YFP) markiert ist. Beide Genfusionsprodukte wurden unter Verwendung des PCR-Primerpaares 5′-ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC-3′ und 5′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′ amplifiziert und unter Verwendung der XhoI- und BsrGI-Restriktionsstellen in das pTRIP-delta U3 CMV-Plasmid eingefügt. Die Vermeidung von mehr als 20 Passagen und die Aufrechterhaltung der Zellen bei weniger als 60 % Konfluenz tragen dazu bei, eine gute Transfektionseffizienz zu gewährleisten.
- An Tag 1 spalteten sich HEK-293T-Zellen mit 30 - 40 % Konfluenz in einer Gewebekulturplatte mit einem Durchmesser von 10 cm (3 x 10⁶ Zellen/Schale) in 10 ml Zellkulturmedium (hochglukosereiches DMEM mit 10 % FBS und 4 mM L-Glutamin) für die Virusproduktion.
- Bewahren Sie die Gewebekulturplatte mit einem Durchmesser von 10 cm über Nacht in einem CO₂-Inkubator (37 °C, 5 % CO₂) auf.
- An Tag 2 wird eine DNA-Transfektionslösung hergestellt, die 10 μg lentivirale Vektoren (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP oder -SOD1A4V-YFP) zusammen mit den lentiviralen Verpackungsplasmiden (5 μg pVSVg; 10 μg pCMV-dR8.71) enthält (Abbildung 1A). Fügen Sie 125 μl 1 M CaCl₂ hinzu und stellen Sie das Volumen mit destilliertem Wasser auf 500 μl ein. Geben Sie vorsichtig 500 μl 0,05 M HEPES in die Mischung und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Ersetzen Sie das HEK-293T-Zellmedium durch 10 mL vorgewärmtes frisches Kulturmedium, antibiotikafrei, gemischt mit 1 mL DNA-Transfektionslösung, und inkubieren Sie es über Nacht bei 37 °C, 5 % CO₂.
- Ersetzen Sie den Zellüberstand an Tag 3 durch frisches Kulturmedium.
- Ernten Sie an Tag 4 den Überstand in einem 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie ihn 5 Minuten lang bei 500 x g, um die abgestorbenen Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Reinigen Sie den Überstand weiter, indem Sie ihn mit einer großen 60-ml-Spritze durch einen 0,45-μm-Filter leiten. Sofort in Einmal-Aliquots (300 μl) abgeben und bei -80 °C lagern. Um eine maximale Produktaktivität zu erhalten, vermeiden Sie einen Gefrier-Tau-Zyklus.
2. Lentivirale Transduktion
- Teilen Sie die zu infizierende Zelllinie bei 60 % Konfluenz (HEK-293-Zellen und SH-SY5Y; 5 x 10⁵ Zellen pro Well und U2OS; 1 x 10⁵ Zellen pro Well) in einer 6-Well-Gewebekulturplatte in 2 ml DMEM-Medien, ergänzt mit 10 % FBS.
- Bewahren Sie die 6-Well-Gewebekulturplatte über Nacht in einem 37 °C heißen Inkubator bei 5 % CO₂ auf.
- Nehmen Sie das gefrorene Lentivirus aus dem -80 °C Gefrierschrank und tauen Sie vor jedem Gebrauch ein Aliquot auf Eis auf; nicht wieder einfrieren.
- Während das Virus auftaut, erwärmen Sie das Zellkulturmedium, das das Serum enthält, das mit der gewünschten Zelllinie kompatibel ist. Sobald das Virus vollständig aufgetaut ist, bereiten Sie eine Reihe von Verdünnungen (1:3, 1:10, 1:30 und 1:100) in DMEM in einem frischen 1,5-ml-Mikrofuge-Röhrchen vor.
- Erhöhen Sie das Volumen in den Röhrchen auf 1 mL mit reduziertem Serummedium.
- 2 μl Polybrene (bei einem Stamm von 4 μg/μl) zu 1 ml Virus/Medium hinzufügen. Durch Pipettieren gut mischen und 1 ml der Mischung in die Zellen geben. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang mit dem Virus.
- Entfernen Sie die Virenmedien und ersetzen Sie sie durch normale DMEM-Medien, die mit 10 % FBS angereichert sind. Halten Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO₂.
- Überwachen Sie das Wachstum der Zellen und wechseln Sie die Nährmedien alle zwei Tage. Erweitern Sie die 6-Well-Schale am Zusammenfluss zu einer Gewebekulturplatte mit einem Durchmesser von 10 cm.
- Sobald die Zellen ausreichend expandiert sind, säen Sie 1,5 x 10⁴ Zellen pro Well in 50 μl DMEM-Medien auf 384-Well-Assay-Platten, um das Expressionsniveau des YFP-markierten Proteins durch Mikroskopie zu überprüfen. Wenn die Expression der YFP-markierten Proteinzelle ein Signal-Rausch-Verhältnis ≥3 aufweist, bereiten Sie das Zellmaterial für die entsprechende Zelllinie vor.
3. Zeitabhängige Wirkung des Proteasom-Inhibitors auf die Proteinaggregation
HINWEIS: Führen Sie die Bildaufnahme mit einem automatisierten Mikroskop durch (siehe Materialien).
- Dispensieren Sie 0,25 μl DMSO oder Proteasom-Inhibitor, gelöst in 100 % DMSO (ALLN, 2 mM), auf 384-Well-Platten mit flachem Boden.
- 1,5 x 104 Zellen pro Well in 50 μl DMEM-Medium auf derselben Assay-Platte manuell aussäen. Die Endkonzentration des Proteasom-Inhibitors (ALLN) sollte 10 μM betragen.
- Richten Sie die Klimakontrolleinheit des Mikroskopsystems auf 37 °C und 5 % CO₂ ein. Ein Screenshot des Versuchsaufbaus ist in Abbildung 2 dargestellt.
- Betreiben Sie das Mikroskop im Weitfeld-Fluoreszenzmodus und verwenden Sie die Software mit den folgenden Einstellungen: LWD 20X-Objektiv, nicht-konfokaler Modus, 4 Felder/Well, mit einem Aufnahmeintervall von einer Stunde. Am Ende jeder Ausführung werden die erfassten Bilder automatisch auf den Server hochgeladen.
4. Zeitraffer-Bildgebung für die YFP-Expression in lebenden Zellen und Bildanalyse (Einzelkanal)
HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben die Anwendung der Software (z.B. Columbus).
- Wählen Sie den geeigneten Algorithmus aus, um die primären Objekte (Zytosol und Aggregate) zu segmentieren. Passen Sie bei Bedarf die Parameter für den Hintergrundschwellenwert und den Kontrast an (Abbildung 3).
- Zählen Sie Zellen mit "Zellen finden" mit einem individuellen Schwellenwert von 0,1 für den YFP-Intensitätskanal. Bestimmen Sie Aggregate mit einem "Find Spots"-Algorithmus mit einer relativen YFP-Spot-Intensität von >0,2 und einem Splitting-Koeffizienten von 1,0.
5. Dosis-Wirkungs-Effekt von Proteasom-Inhibitoren auf die Proteinaggregation an lebenden Zellen, die für ihre Zellkerne gefärbt sind (zwei Kanäle)
HINWEIS: Führen Sie die Bildaufnahme mit einem automatisierten Mikroskop durch. Bestimmen Sie den Konzentrationsbereich von Proteasom-Inhibitoren (ALLN, Epoxomicin und MG132) basierend auf dem erwarteten IC50-Wert, um eine optimale Kurvenanpassung zu gewährleisten.
- Bereiten Sie serielle Verdünnungen von Verbindungen auf einer 384-Well-Lagerplatte aus Polypropylen mit der standardmäßigen 1:3-Verdünnungsreihe vor. Stellen Sie sicher, dass die Verdünnungen der Verbindungen gut gemischt werden, um sicherzustellen, dass die Konzentrationen der Verbindungen genau sind.
- Dispensieren Sie 0,25 μl Proteasom-Inhibitoren auf leere schwarze 384-Well-Assay-Platten mit flachem Boden. Wir verwenden einen Liquid Handler, der mit einem 384-Kapillarkopf ausgestattet ist, der in der Lage ist, Volumina zu übertragen.
- 1,5 x 1010⁴ Zellen pro Well in 50 μl DMEM-Medien auf Assay-Platten säen. Inkubieren Sie die Assay-Platten bei 37 °C und 5 % CO₂ für 24 h.
- 10 μl DMEM-Medium (vorgewärmt auf 37 °C) mit Färbelösung (Hoechst 33342 mit einem Vorrat von 10 mg/ml) zugeben und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Starten Sie die Mikroskop-Betriebssoftware. Ein Screenshot des Versuchsaufbaus ist in Abbildung 4 dargestellt. Wählen Sie die Registerkarte "Konfiguration" und wählen Sie das 20X-Objektiv und den richtigen Plattentyp aus. Stellen Sie sicher, dass der "Kragen" auf dem Objektiv auf den richtigen Wert eingestellt ist, um eine korrekte Fokussierung mit verschiedenen Plattentypen zu ermöglichen.
- Wählen Sie den Reiter "Mikroskop" und definieren Sie Belichtung 1 als YFP (488 Laser) und Belichtung 2 als Hoechst (405 Laser). Aktivieren Sie den Filter für beide Belichtungen und weisen Sie Belichtung 1 Kamera 1 und Belichtung 2 Kamera 2 zu. Stellen Sie die Belichtungszeiten auf ~800 ms für Belichtung 1 und ~40 ms für Belichtung 2 ein.
- Wählen Sie Belichtung 1. Stellen Sie die Fokushöhe auf 0 μm ein. Wählen Sie "Fokus". Nach dem Fokussieren Kamera 1 belichten. Passen Sie die Fokushöhe an, um die Belichtungsebene zu optimieren und klicken Sie auf "Höhe nehmen". Ändern Sie die Belichtungszeiten und die Laserleistung, um eine maximale Pixelintensität von ~3.000 zu erhalten. Speichern Sie die Belichtungsparameter. Wiederholen Sie den Vorgang für Belichtung 2.
- Wählen Sie die Registerkarte "Experimentdefinition". Erstellen Sie ein Layout und ein Unterlayout. Ziehen Sie das relevante Layout, die Belichtung, das Referenzbild, die Skewcrop-Datei und das Unterlayout per Drag & Drop. Speichern Sie das Experiment.
- Wählen Sie die Registerkarte "Automatisches Experiment" und nehmen Sie Bilder auf. Am Ende jeder Ausführung werden die erfassten Bilder automatisch auf den Server hochgeladen.
6. Bildanalyse von Zweikanalbildern
- Wählen Sie den Softwarealgorithmus aus, um die primären Objekte (Kerne, Zytosol und Aggregate) zu segmentieren (Abbildung 5).
- Wählen Sie die Methode aus, mit der Kerne durch visuelle Inspektion der segmentierten Objekte genau segmentiert werden. Hoechst-gefärbte Objekte in Kanal 1 (Ch1) werden zur Bestimmung der Zellzahl verwendet. Die YFP-Färbung der Mutante SOD1-A4V in Kanal 2 (Ch2) wird verwendet, um die Menge der Aggregate zu bestimmen.
- Zählen Sie Zellen mit dem "Zellkerne finden"-Algorithmus als Hoechst-Färbebereiche >20 μm², mit einem Split-Faktor von 7,0, einem individuellen Schwellenwert von 0,40 und einem Kontrast >0,10.
- Erstellen Sie die Datentabelle und bestimmen Sie EC50 für jede der Verbindungen mithilfe der Gleichung "Nichtlineare Regression" in der Grafiksoftware.
