Alle Eingriffe, an denen menschliche Teilnehmer beteiligt sind, wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
1. Endotoxin-Aktivitäts-Assay (EAA)
- Entnahme von Blutproben des Patienten in sterilen Röhrchen, die EDTA-Antikoagulans enthalten. Lagern Sie Blutproben bei Raumtemperatur
- Bereiten Sie die EA-Reagenzgläser für jede Blutprobe des Patienten vor, die Sie testen müssen. Legen Sie die Röhrchen in Röhrchengestelle. Entfernen Sie dann die Kappen.
- Jeder EA-Test besteht aus 5 verschiedenen Arten von Röhrchen; verwenden Sie jedes für einen anderen Teil des Tests (siehe nächste Schritte).
- Verwenden Sie das Röhrchen #1 (das "Kontroll"-Röhrchen), um die basale Aktivität des unspezifischen oxidativen Ausbruchs der Neutrophilen des Patienten in Abwesenheit eines spezifischen Antikörpers zu messen.
- Verwenden Sie das Röhrchen #2 (das "Proben"-Röhrchen), um den oxidativen Ausbruch als Reaktion auf den Lipopolysaccharid (LPS)-Antikörperkomplex zu messen.
- Verwenden Sie das Rohr #3 (das "Max"-Rohr), um den maximalen oxidativen Ausbruch der Neutrophilen des Patienten als Reaktion auf einen Überschuss an Endotoxin zu messen.
- Verwenden Sie Röhrchen #4 (das "LPS"-Röhrchen) als Quelle für exogenes Endotoxin.
- Verwenden Sie das Sonde #5 ("Aliquot"-Röhrchen) für die Blutaufbewahrung.
HINWEIS: Duplikate der Röhrchen #1, #2 und #3 werden für insgesamt 8 Röhrchen bereitgestellt, die für jede zu testende Blutprobe verwendet werden (die EA-Reagenzflasche und der Qualitätskontrolltest können für alle Tests verwendet werden, die in einem Beutel enthalten sind).
- Pipettieren Sie mit einer Kombipipette ein Volumen von 1 ml des EA-Reagenzes aus der Flasche in die Röhrchen #1 (Kontrollröhrchen), #2 (Probenröhrchen) und #3 (Max. Röhrchen), jeweils in doppelter Ausfertigung.
HINWEIS: Pipettieren Sie an der Seite des Röhrchens entlang, um zu vermeiden, dass die Lösung wieder nach oben spritzt.
- Mischen Sie die Blutprobe des Patienten, indem Sie das Blutentnahmeröhrchen 20 Mal vorsichtig umdrehen. Pipettieren Sie dann 0,5 ml Patientenblut in das Röhrchen #4 (LPS max-Röhrchen) und das Röhrchen #5 (Aliquot-Röhrchen). Vortex-Rohr #4 für 10 s.
- Legen Sie die Röhrchenracks mit allen EA-Reagenzgläsern in den Inkubatorschüttler. Den Deckel schließen und 10 min bei einer Temperatur von 37°C inkubieren.
- Öffnen Sie den Deckel und nehmen Sie die Röhrchengestelle aus dem Inkubatorschüttler. Vortex-Rohr #5 (Aliquot-Rohr). Pipettieren Sie mit einer sterilen Spitze 40 μl Blut in die Röhrchen #1 und #2, in doppelter Ausführung.
- Vortex-Röhre #4 (LPS-Röhre). Pipettieren Sie mit derselben Pipettenspitze 40 μl Blut aus dem Röhrchen #4 in das Röhrchen #3 (Max. Röhrchen) in doppelter Ausführung.
- Wirbeln Sie die sechs endgültigen Reagenzgläser (#1, #2, #3 und entsprechende Duplikate) vor und legen Sie sie dann wieder in ihre Racks.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Rohre für die gleiche Zeit vortext werden.
- Setzen Sie die Röhrchengestelle wieder in den Inkubationsschüttler ein und schließen Sie den Deckel. Stellen Sie den Inkubationsschüttler auf 100 U/min ein und starten Sie die Bewegung für 14 Minuten.
- Legen Sie die mit EA gekennzeichnete Chipkarte in das Chemiluminometer ein und drücken Sie Start. Befolgen Sie nach der 14-minütigen Inkubation die Anweisungen auf dem Chemiluminometer, um die EA-Röhrchen in der richtigen Reihenfolge abzulesen.
- Wirbeln Sie jedes Röhrchen 10 s lang vorsichtig ein, bevor Sie es auf den Probenhalter des Chemiluminometers legen. Öffnen Sie die Probenschublade und legen Sie das Röhrchen #1 in den Probenhalter. Schließen Sie dann die Probenschublade und warten Sie, bis die RLU-Anzeige (Relative Light Unit) angezeigt wird.
- Wiederholen Sie Schritt 1.12 für Röhrchen 2 und Röhrchen 3.
- Wiederholen Sie Schritt 1.12 für doppelte Röhren 1, 2 und 3.
Anmerkung: Versuchen Sie, alle Röhren in den Schritten 1.12 bis 1.14 gleich lange zu wirbeln.
- Nachdem alle Röhrchen verarbeitet wurden, beachten Sie, dass die EA-Ergebnisse automatisch berechnet und gedruckt werden. Die Niveaus werden als EA-Einheiten ausgedrückt und stellen den Mittelwert doppelter Bestimmungen aus denselben Stichproben dar.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.4 bis 1.15 für jede Blutprobe, die getestet werden muss.
- Lagern Sie nach Abschluss des Assays die restlichen Reagenzgläser und EA-Reagenzien bis zu 30 Tage lang bei 2–8 °C.