Turbidimetrischer Limulus-Amöbozyten-Lysat-Assay: Eine Technik zum Nachweis und zur Quantifizierung von Endotoxin-Kontamination in nanoformulierten Arzneimitteln

Zusammenfassung

Quelle: Neun, B. W. et al., Nachweis von Endotoxin in Nanoformulierungen mit Limulus-Amöbozyten-Lysat (LAL)-Assays. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video beschreibt das turbidimetrische Format des Limulus-Amöbozyten-Lysat- oder LAL-Assays zur Abschätzung der Endotoxin-Kontamination in PEGylierten liposomalen Doxorubicin-Nanoformulierungen. Die Trübung der Lösung nach der Reaktion des Endotoxins mit dem LAL-Reagenz hilft bei der Abschätzung des Endotoxins in der Probe.

Protokoll

1. Vorbereitung von Nanopartikelproben

1. Bereiten Sie die Untersuchungsprobe in Wasser in LAL-Qualität vor.
2. Wenn der pH-Wert der Probe außerhalb des Bereichs von 6-8 liegt, stellen Sie den pH-Wert mit pyrogenfreiem Natriumhydroxid oder Salzsäure ein.
3. Bereiten Sie mit LAL-Wasser mehrere Verdünnungen der Studienprobe vor. Stellen Sie sicher, dass die höchste Verdünnung die maximal gültige Verdünnung (MVD) nicht überschreitet.

2. Vorbereitung von Reagenzien, die bei LAL-Formaten üblich sind

1. Verdünnen Sie den konzentrierten Natronlauge mit pyrogenfreiem LAL-Reagenzwasser, um eine Arbeitslösung mit einer Konzentration von 0,1 N herzustellen.
2. Konzentriertes Salzsäurematerial wird mit pyrogenfreiem LAL-Reagenzwasser verdünnt und eine Arbeitslösung mit einer Endkonzentration von 0,1 N hergestellt.
3. Erstellung des Kontrollstandards Endotoxin (CSE)
   1. Rekonstituieren Sie die CSE gemäß dem vom Hersteller gelieferten Analysezertifikat.
      Anmerkung: In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zur Katalognummer und zur Anwendung einer bestimmten CSE-Formulierung in verschiedenen LAL-Formaten.
4. Vorbereitung des LAL-Reagenzes
   1. Rekonstituieren Sie das LAL-Reagenz gemäß dem vom Hersteller ausgestellten Analysezertifikat.
      Anmerkung: In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zur Katalognummer und zur Anwendung einer bestimmten LAL-Reagenzformulierung in verschiedenen LAL-Formaten.

3. Trübungs-LAL-Assay

1. Vorbereitung der Kalibrierstandards
   1. Bereiten Sie unter Verwendung von 900 μl Wasser in LAL-Qualität und 100 μl CSE so viele Zwischenverdünnungen wie nötig vor, um die Herstellung eines Kalibrierstandards mit einem Konzentrationsbereich von 0,001 bis 1 EU/ml zu ermöglichen.
   2. Etikettieren Sie zuerst die Röhrchen und geben Sie 900 μl Wasser in LAL-Qualität in jedes Röhrchen. Fügen Sie dann 100 μl 10 EU/ml-Lösung hinzu, um einen Kalibrierstandard mit einer Konzentration von 1EU/ml herzustellen.
   3. Wiederholen Sie die serielle 10-fache Verdünnung wie oben beschrieben, um drei niedrigere Kalibrierstandards herzustellen. Stellen Sie sicher, dass vier Kalibrierstandards im Bereich von 0,001 bis 1 EU/ml erstellt wurden.
2. Vorbereitung der Qualitätskontrollen
   1. Bereiten Sie eine Qualitätskontrolle von 0,05 EU/ml vor, indem Sie 50 μl der 1 EU/ml-CSE-Lösung mit 950 μl Wasser in LAL-Qualität kombinieren.
3. Vorbereitung von Inhibition/Enhancement (IEC)-Kontrollen
   1. IEC mit einer Konzentration von 0,05 EU/ml herstellen, indem 25 μl der 1 EU/ml-CSE-Lösung und 475 μl des Test-Nanomaterials in einer bestimmten Verdünnung kombiniert werden.
4. Experimentelles Vorgehen
   1. Lassen Sie das Instrument aufwärmen, indem Sie es etwa 30 Minuten vorher einschalten. Stellen Sie die Detektionswellenlänge auf 660 nm ein, da dies für die Trübungs-LAL geeignet ist.
   2. Melden Sie sich an, indem Sie den Benutzernamen und das Passwort eingeben.
   3. Öffnen Sie die Software (Materialtabelle), indem Sie auf das entsprechende Symbol auf einem Computerbildschirm klicken.
   4. Wählen Sie auf dem Startbildschirm der Software die Option Daten sammeln aus. Geben Sie die Test-ID und die Datengruppeninformationen in das entsprechende Feld auf der Registerkarte Allgemein auf dem Startbildschirm ein.
   5. Klicken Sie auf die Registerkarte Hardware. Wählen Sie den Gerätetyp aus einem Dropdown-Menü aus.
   6. Stellen Sie die Detektionswellenlänge auf 660 nm ein, da dies für die Trübungs-LAL geeignet ist, indem Sie die LAL-Trübungsmethode wählen.
   7. Vergewissern Sie sich, dass eine Seriennummer, eine System-ID und Informationen zum seriellen Anschluss auf dem Bildschirm angezeigt werden. Klicken Sie auf OK. Klicken Sie zur Bestätigung noch einmal auf OK.
   8. Geben Sie die Proben-ID in der gleichen Reihenfolge ein, in der die Probe getestet wird. Verwenden Sie die Standardtasten, um die Negativkontrolle, die Normkurve und die Prüfmuster einzugeben.
   9. Bereiten Sie für jede Probe Duplikate vor und geben Sie 200 μl (Testverhältnis 4:1) oder 100 μl (Testverhältnis 1:1) Negativkontrolle (Wasser), Kalibrierstandards, Qualitätskontrolle, IEC und Testnanopartikel in vormarkierte Glasröhrchen.
   10. Geben Sie 50 μl (Testverhältnis 4:1) oder 100 μl (Testverhältnis 1:1) LAL-Reagenz in das erste Testfläschchen, wirbeln Sie es kurz vor und setzen Sie es in den Testschlitz im Instrumentenkarussell ein. Wenn das Verhältnis 1:1 verwendet wird, beträgt das Volumen des LAL-Reagenzes 100 μl.
   11. Wiederholen Sie das oben beschriebene Verfahren für andere Proben. Verarbeiten Sie Proben nacheinander.
        

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Natriumhydroxid	Sigma	Nr. S2770	Bei Bedarf wird es verwendet, um den pH-Wert der Probe auf einen Wert zwischen 6 und 8 einzustellen
Salzsäure	Sigma	Nr. H9892	Bei Bedarf wird es verwendet, um den pH-Wert der Probe auf einen Wert zwischen 6 und 8 einzustellen
LAL-Reagenz	Partner von Cape Cod	Nr. T0051	Dieses Reagenz kann nur mit Trübungsassays verwendet werden
Endotoxin-Standard kontrollieren	Partner von Cape Cod	Nr. E0005	Dieses Reagenz kann mit Trübungs- und Gelgerinnsel-Assays verwendet werden
Wasser in LAL-Qualität	Partner von Cape Cod	Artikelmappe WP0501	Dieses Reagenz kann mit jedem LAL-Format verwendet werden
Glucashield Puffer	Partner von Cape Cod	Artikel-Nr.: GB051-25	Wird verwendet, um falsch-positive Reaktionen von Beta-Glucanen zu verhindern
Endotoxinfreie Einweg-Verdünnungsröhrchen aus Glas 12 x 75 mm	Partner von Cape Cod	TB240	Diese Röhrchen können mit allen drei Assays verwendet werden
Endotoxinfreie Einweg-Reaktionsgefäße aus Glas 8 x 75 mm	Partner von Cape Cod	TK100	Diese Röhrchen können mit Trübungs- und chromogenen Assays verwendet werden
Pyrogenfreie Spitzen mit einem Volumen von 0,25 und 1,0 mL	RAININ	PPT25, PPT10	Spitzen und Pipetten können Endotoxine adsorbieren und auslaugbare Stoffe freisetzen, die den LAL-Assay beeinträchtigen. Diese RAININ-Spitzen werden verwendet, da ihre optimale Leistung im LAL-Assay verifiziert und bestätigt wurde
Pyrogenfreie Mikrozentrifugenröhrchen, 2,0 mL	Eppendorf	22600044	Andere gleichwertige Verbrauchsmaterialien können verwendet werden
Pyrogen-fee Kombispitzen, 5mL	Eppendorf	30089669	Andere gleichwertige Verbrauchsmaterialien können verwendet werden
Pipettierer wiederholen	Eppendorf	4982000020	Andere gleichwertige Verbrauchsmaterialien können verwendet werden
Mikrozätrifuge	Jede Marke		Jede Marke kann verwendet werden
Kühlschrank, 2-8 C	Jede Marke		Jede Marke kann verwendet werden
Wirbel	Jede Marke		Jede Marke kann verwendet werden
Gefrierschrank, -20 C	Jede Marke		Jede Marke kann verwendet werden
Pyros Kinetix oder Pyros Kinetix Flex Lesegerät	Partner von Cape Cod	PKF96	Andere Instrumente können verwendet werden. Die in diesem Assay verwendeten LAL-Reagenzien und Endotoxinstandards müssen jedoch möglicherweise optimiert werden. Wenn andere Instrumente verwendet werden, wenden Sie sich bitte an die Hersteller des Instruments und des LAL-Kits, um Anweisungen zu erhalten