1. Vorbereitung von Nanopartikelproben
- Bereiten Sie die Untersuchungsprobe in Wasser in LAL-Qualität vor.
- Wenn der pH-Wert der Probe außerhalb des Bereichs von 6-8 liegt, stellen Sie den pH-Wert mit pyrogenfreiem Natriumhydroxid oder Salzsäure ein.
- Bereiten Sie unter Verwendung von LAL-Wasser mehrere Verdünnungen der Studienprobe vor. Stellen Sie sicher, dass die höchste Verdünnung die maximal gültige Verdünnung (MVD) nicht überschreitet.
2. Vorbereitung von Reagenzien, die bei LAL-Formaten üblich sind
- Verdünnen Sie den konzentrierten Natronlauge mit pyrogenfreiem LAL-Reagenzwasser, um eine Arbeitslösung mit einer Konzentration von 0,1 N herzustellen.
- Konzentriertes Salzsäurematerial wird mit pyrogenfreiem LAL-Reagenzwasser verdünnt und eine Arbeitslösung mit einer Endkonzentration von 0,1 N hergestellt.
- Erstellung des Kontrollstandards Endotoxin (CSE)
- Rekonstituieren Sie die CSE gemäß dem vom Hersteller gelieferten Analysezertifikat.
Anmerkung: In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zur Katalognummer und zur Anwendung einer bestimmten CSE-Formulierung in verschiedenen LAL-Formaten.
- Vorbereitung des LAL-Reagenzes
- Rekonstituieren Sie das LAL-Reagenz gemäß dem vom Hersteller ausgestellten Analysezertifikat.
Anmerkung: In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zur Katalognummer und zur Anwendung einer bestimmten LAL-Reagenzformulierung in verschiedenen LAL-Formaten.
3. Gel-Gerinnsel LAL
HINWEIS: Dieser Assay identifiziert das Vorhandensein von Endotoxinen in der Probe basierend auf der visuellen Beobachtung und dem Nachweis eines Gerinnsels im Reaktionsröhrchen. Die experimentellen Schritte werden im Folgenden beschrieben. Verwenden Sie ein Bankblatt, um die Ergebnisse aufzuzeichnen. Dieses Tischblatt ist nicht obligatorisch, und andere Methoden zur Aufzeichnung der Untersuchungsergebnisse sind ebenfalls akzeptabel. Ein Beispiel für ein solches Bankblatt ist in ergänzenden Materialien zur Bequemlichkeit eines Lesers bereitgestellt. Lambda (l) ist die Sensitivität des Gelgerinnsel-Assays und beträgt 0,03 EU/ml.
- Beschriften Sie so viele Reaktionsgefäße wie nötig, um die Anzahl der analysierten Testproben aufzunehmen. Einzelheiten zur Anzahl der Replikate, die in Schritt 1, Schritt 2 und Schritt 3 des Assays verwendet wurden, finden Sie auf dem Laborblatt.
- Aliquotieren Sie 100 μl Wasser, Kontroll- oder Testprobe pro Röhrchen.
- CSE wird so vorbereitet, dass die Endkonzentration 4λ beträgt.
- Kombinieren Sie 100 μl des oben genannten Standards mit 100 μl Wasser oder Testprobe, um die endgültige CSE-Konzentration von 2 λ zu erreichen. Wiederholen Sie den Vorgang noch dreimal, um Lambda und Halb-Lambda und ein Viertel Lambda zu erreichen.
- Achten Sie darauf, dass die Temperatur im Wasserbad 37 °C beträgt.
- 100 μl Lysat pro Reagenzglas zugeben, kurz vortexen und das Gestell mit allen Röhrchen für 1 h in das Wasserbad stellen.
- Drehen Sie das Rohr mit einer sanften Bewegung um.
- Notieren Sie die Ergebnisse manuell mit "+" (festes Gerinnsel) oder "-" (kein Gerinnsel oder loses Gerinnsel) auf dem Bankblatt.
- Fahren Sie mit der Analyse gemäß USP BET 85 fort, verwenden Sie das Bankblech als Stützmaterial.